冯长海

(宁波美康盛德医学检验所有限公司，浙江宁波 315100)

改良透明胶带法在丝状真菌形态观察中的应用

冯长海

(宁波美康盛德医学检验所有限公司，浙江宁波 315100)

目的建立一种操作简单且显微成像效果较佳的丝状真菌制片技术。方法将玻片的非毛玻璃端粘贴一层透明胶带，其上垂直平贴粘有真菌的透明胶带，真菌刚好邻近两条胶带的交叉线，然后在胶带交叉处侧面滴加微量乳酸酚棉蓝，待染液浸染真菌后，镜下观察真菌的形态特征。结果改良透明胶带法制片观察可见，真菌孢子形态、特征及孢子间、菌丝间、孢子和菌丝间位置排列较清晰，镜检效果尚佳。结论改良透明胶带法与传统透明胶带法相比，乳酸酚棉蓝染色镜检背景清晰、丝状真菌完整的典型结构较易获得，但存在丝状真菌有时不在同一平面导致成像模糊的缺陷，仍需进一步研究。

透明胶带法；丝状真菌；形态学；显微成像

透明胶带法是微生物实验室常用的形态学鉴定丝状真菌方法，操作简单，快速有效，在真菌形态学鉴定中发挥非常重要的作用[1-3]。但使用透明胶带法镜检时常会出现真菌孢子间、菌丝间、孢子和菌丝间位置排列关系混乱，不易出现真菌的典型结构，造成真菌形态学鉴定结果不可靠。本文将透明胶带法进行改良，从乳酸酚棉蓝作为浮载液，试用于曲霉、毛霉等12种真菌，取得较好的显微镜检效果，现报告如下。

1 材料与方法

1.1试剂 乳酸酚棉蓝，马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基。

1.2耗材 透明胶带(宽18 mm)，载玻片(一端为毛玻璃)，一次性无菌加样枪头。

1.3菌种 构巢曲霉、烟曲霉、毛霉、横梗霉、根霉、多育赛多孢、申克孢子丝菌、白僵菌、明脐霉、弯孢霉、断发毛癣菌、红色毛癣菌，来源于美国病理学家协会(College of American Pathologists，CAP)的能力验证活动(proficiency testing，PT)样本，转种PDA斜面、密封后室温保存。

1.4方法 将实验菌株接种在PDA培养基上25 ℃培养，待菌株成熟后备用。取一张95%乙醇浸洗后的洁净玻片，毛玻璃端可标记菌种编号，另一端覆盖透明胶带，称为胶带端(见图1A)；另取一段透明胶带，用无菌镊子夹住胶带两端，使胶带呈气球状，用气球状胶带的顶端粘取真菌菌落(见图1B)；将粘取真菌菌落的胶带的一端粘贴于玻片的胶带端，缓慢松开镊子，使胶带的另一端向玻片毛玻璃端平铺(注意胶带和玻片间尽量避免形成较大空隙)，而粘取的真菌刚好邻近两条胶带垂直相交的交叉线(见图1C)；用加样枪取约5 μL乳酸酚棉蓝(浮载液量可根据粘取菌量稍作调整)，沿胶带交叉处侧面缓慢加入(见图1D)，待菌体充分浸染后镜检。

注：A，透明胶带(箭头所指)粘贴在玻片非毛玻璃端;B，透明胶带粘取真菌菌落;C，粘有真菌的透明胶带平铺于玻片;D，两条透明胶带交叉处加入乳酸酚棉蓝。1504为CAP2015年4号PT样本分离的烟曲霉菌编号。

图1 改良透明胶带法制片流程

2 结果

改良后的透明胶带法试用于曲霉、毛霉等菌株取得较好的显微成像效果，实验菌株镜下均出现完整的特征结构。见图2。

图2 实验菌株乳酸酚棉蓝染色后镜检效果

3 讨论

传统的透明胶带法是将浮载液先滴加于玻片上，然后将粘有真菌的透明胶带平贴于玻片上，真菌和浮载液接触后再和玻片接触。丝状真菌的形态特征在接触浮载液、平铺固定于玻片的过程中会出现改变：浮载液接触真菌时的表面张力和液体的流动力以及胶带的平铺力均可破坏真菌孢子排列方式，如曲霉镜下孢子散乱，难见典型的曲霉头完整结构或曲霉头结构不清晰，很难获得背景清晰，结构典型完整的图像。改良透明胶带法是将粘有丝状真菌的胶带直接平铺于玻片上，即将悬空的丝状真菌固定于胶带后再用浮载液浸染；2张胶带间形成的微小空隙也限制了浸染真菌的浮载液量及染液扩散速度。虽然这种固定真菌形态的方法也并不牢固，浮载液作用后也可见零乱的孢子，但采用此法后，显微镜下较易获得背景清晰，结构典型完整的图像，说明浮载液浸染对真菌形态破坏力较弱，真菌形态特征能够较好维持。

同透明胶带法一样，改良方法也存在诸多缺点，如制片需在生物安全柜中处理，蜡样菌落形态及难见气生菌丝的真菌制片后显微成像效果不佳，乳酸酚棉蓝染色后的玻片放置过久会出现染液混浊、镜下视野模糊不清现象，镜下视野中也会出现气泡，胶带和玻片间若空隙较大会出现如文中明脐霉菌体不在一个水平面的现象等，推测是两胶带形成的空隙间丧失了镜下对焦平面，大多数结构可能不在一个对焦平面上，肉眼观察影响不大，但拍照时有难度。由于改良方法使用的是浸染技术，真菌接触的乳酸酚棉蓝染液量较少，有些真菌可能会出现不着色或着色浅现象，如文中申克孢子丝菌和白僵菌；有些真菌可能会因为两片交叉胶带形成的微小斜面导致背景色深、图像模糊，如文中断发毛癣菌和红色毛癣菌。以上缺点的解决还需继续研究，改变胶带的成分和/或优化染液的质量可能是研究的方向。

由于本法属开放式作业，操作时需在生物安全柜内进行，待丝状真菌浸染充分后，用乳酸酚棉蓝浸润初始加染液端的对侧，即粘有丝状真菌胶带两侧均浸有染液，可起到杀抑真菌，保护实验室工作人员的作用；不可直接在玻片两端都加入染液，否则会导致胶带中央出现较大气泡，影响染色成像效果。

[1]Hughes AD，Lorusso GD，DL Greer. The ′double-layer tape prep′: an improvement to a standard technique[J]. J Med Microbiol, 2004, 53(Pt5):455.

[2]陈东科，孙长贵. 实用临床微生物学检验与图谱[M]. 北京：人民卫生出版社, 2011:626-655.

[3]P.R.默里，E.J.巴伦，M.A.特诺维，等.临床微生物手册[M].北京：科学出版社, 2005：1827-1830.

2017-06-07)

(本文编辑：刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.07

冯长海，1970年生，男，副主任技师，硕士，从事真菌的形态学鉴定，细菌耐药机制研究。

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