粟阳萌，童治军，李梅云，焦芳婵，耿素祥，李永平

1 湖南农业大学生物科学技术学院, 长沙, 410128;2 云南省烟草农业科学研究院,烟草生物技术育种重点实验室, 国家烟草基因工程研究中心, 昆明, 650021;3 山东中烟工业有限责任公司, 济南, 250014

生物技术

一个与烟草TMV 抗性基因N 紧密连锁的共显性SSR 标记

粟阳萌1,2，童治军2，李梅云2，焦芳婵2，耿素祥3，李永平2

1 湖南农业大学生物科学技术学院, 长沙, 410128;2 云南省烟草农业科学研究院,烟草生物技术育种重点实验室, 国家烟草基因工程研究中心, 昆明, 650021;3 山东中烟工业有限责任公司, 济南, 250014

烟草普通花叶病（Tobacco Mosaic Virus, TMV）是烟叶生产的主要病害，为建立烟草抗TMV分子标记辅助选择体系，本研究以高抗TMV烤烟品种Coker176和易感TMV烤烟品种Y3以及它们的BC1F1群体为试材，采用分离集团分组分析法（Bulked Segregation Analysis, BSA）和简单序列重复（Simple Sequence Repeat, SSR）标记技术，筛选与TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记。通过对18764对SSR引物的分析表明，有396对SSR引物在两亲本间有多态，选出1对SSR引物TM508-007扩增出的标记与TMV抗性的N基因紧密连锁，遗传连锁距离为0.41 cM，证实获得的与TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记稳定可靠，可用于烟草抗TMV分子标记辅助选择。

烟草；烟草花叶病；分离集团分组分析法；共显性SSR标记

烟草普通花叶病是由烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus, TMV）引起的，TMV是第一个被鉴定的单链正义病毒[1]，属于花叶病毒家族[2]，具有传染活性[3]。可侵染包括烟草在内的茄科作物，影响烟叶的产量和品质，选育抗病品种、提高烟草的抗病性是防治TMV的根本途径。N基因是编码烟草花叶病毒抗性的显性单基因[4]，属TIR-NBS-LRR类抗病基因，通过转座子标签法从烟草野生种粘毛烟草(Nicotiana glutinosa)克隆得到[5]。N基因很容易进入育种程序且能够很快在选育品种中稳定下来，仅仅导入N基因就可使烟草具有TMV抗性[6-7]。因此，通过选择具有N基因的育种材料可选出有抗性的基因型[8]。基于烟草普通花叶病抗性基因N的基因组序列，国内外的研究者成功地开发出多个用于检测烟草TMV抗性的分子标记[9-13]，同时建立了相应的检测体系[14]，并将其中的部分检测标记及方法申请了以下三个专利：ZL201010140771.2、ZL201110067006.7、ZL201410135454.X[15-17]。但上述所有基于N基因开发的分子标记均是显性标记，不能区分材料中N基因的全部基因型，即上述显性标记只能分辨出材料中是否含有抗性基因N，而无法进一步地区分出纯合抗性（NN）和杂合抗性（Nn）。有部分标记是基于N基因的全长cDNA进行设计的，在实际检测中涉及到RNA的提取、cDNA的合成及长片段DNA的PCR扩增等过程，检测体系繁琐，而SSR标记重复性好、共显性、易用PCR分析。本研究利用Coker176（抗病亲本，其TMV抗性由N基因控制）和Y3（综合性状优良但易感TMV）构建回交一代（BC1F1）作图群体，采用分离群体分组分析（Bulked Segregant Analysis, BSA）法，筛选与烟草普通花叶病（TMV）N基因连锁的共显性SSR标记。旨在加速分子标记辅助选择（Marker Assistant Selection，MAS）在烟草TMV抗性品种选育中的利用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2014年，以综合性状优良易感TMV的烤烟Y3为母本，抗TMV烤烟材料Coker176（其抗性由N基因控制）为父本，杂交获得F1，2015年以Y3为轮回亲本，获得回交一代（BC1F1）群体。2016年种植两亲本、F1和BC1F1世代材料用于群体分析。以上烤烟种质资源均由云南省烟草农业科学研究院提供。

1.2 亲本、F1代及BC1F1分离群体TMV抗性鉴定

参试试验材料成苗后移栽至大田，行株距为100 cm × 50 cm；移栽3周后参照李梅云等方法接种TMV[18]。病害严重度的分级标准按国家标准GB/T 23222-2008[19]，0～1级定为抗病植株，3～9级定为感病植株。

1.3 SSR标记分析

烟苗4片真叶时，采用改良的CTAB法提取所有参试材料的基因组DNA[20]，用1%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定DNA提取物浓度和纯度。

分离群体分组分析法（Bulked Segregation Analysis, BSA）：选取BC1F1分离群体中的极端抗病（0级抗病）单株和极端感病（9级感病）单株各15株的基因组DNA，等量混合构建抗、感池，进行引物多态性筛选和标记连锁分析。

SSR-PCR的体系配制、产物扩增及扩增产物的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（6%-non-PAGE）检测，参照童治军等的方法进行[21]。SSR标记（引物）由两部分构成，共18764对，其中，PT系列引物5119对[22]，TM系列引物13645对[20,23]。

1.4 数据分析

利用BC1F1群体的123个单株验证PCR扩增条带在两亲本、F1和抗、感池之间具有多态性并且带型一致的引物。对各个单株的带型进行数据统计，抗病杂合条带标记做“H”，感病条带标记做“A”，条带不清晰或者无扩增条带的记做“U”，使用JoinMap 4.0软件对BC1F1分离群体中TMV抗性基因N和共显性SSR标记的分离数据进行遗传连锁分析，计算其连锁距离并绘制连锁图。

2 结果与分析

2.1 烟草TMV抗性N基因DNA池多态性分析

利用18764对SSR引物对抗病亲本Coker176、感病亲本Y3、两亲本间杂交子一代（F1）、抗病池和感病池共5份材料进行PCR扩增，高达99%的引物（18570对）能进行有效扩增获得目的片段，在两亲本间有多态且在F1上呈共显性的标记有396个，其中与目的基因不连锁标记如TM508-103（图1A），由此可知，SSR标记在该群体的两亲本间的多态率极低，仅有2.11%（396/18764）。在产生共显性多态的396个SSR标记中，经抗、感池的进一步分析，最终仅获得1个标记在抗、感亲本间的多态性与抗、感池间的多态性一致（图1B）。从图1中可见，引物TM508-007（F: CACCATGGTTTGGCTTTCAT,R:GCAAAATGCAAAAAGGCAAT）在感病池与感病亲本中的带型完全一致，仅出现1条约220 bp的特异性条带；在抗病池与F1中的带型完全一致，呈现出共显性的两条特异性条带（同时具有抗、感亲本的特异性条带，既具有抗病亲本约228 bp的特异性条带，又具有感病亲本约220 bp的特异性条带）。该结果与烟草TMV抗性基因N属于显性单基因的事实相吻合。

图1 不同SSR标记在5份材料中的PCR扩增结果Fig.1 The banding pattern of PCR ampli fi cation products for fi ve tobacco materials by different SSR markers

2.2 连锁标记的群体单株验证

将获得的与烟草TMV抗性基因N连锁的共显性SSR标记对123株BC1F1单株进行验证（图2）。其中，有66个单株的抗性鉴定结果为感病（编号：1～66），剩余的57个单株的抗性鉴定结果为抗病（编号：67～123）。标记TM508-007的基因型分析结果为：全部的66个感病单株的基因型均与感病亲本Y3一致（扩增出一条约220 bp的特异性条带）；57个抗病单株中，有56个呈现共显性条带（与F1带型一致，抗、感病带型同时呈现），而有1个单株（编号：70）则呈现出单交换，即抗性鉴定的结果为抗性单株，而基因型分析的结果却为感病（仅出现感病基因型的特异条带）。利用Joinmap 4.0 作图软件计算得到该共显性标记（TM508-007）与烟草TMV抗性基因N的连锁距离约为0.41 cM（图3）。

图2 共显性SSR标记TM508-007在123个BC1F1单株中的PCR扩增结果Fig. 2 The results of PCR ampli fi cation products of 123 BC1F1 individuals with the co-dominant SSR marker TM508-007

图3 共显性SSR标记T508-007与烟草TMV抗性基因N的连锁关系Fig.3 Linkage relationship between the TMV resistant gene N of tobacco and co-dominant SSR marker TM508-007

3 讨论与结论

迄今，利用N基因开发的标记进行烟草标记辅助育种在国内外已有报道。高玉龙等根据烟草TMV抗性基因N的核苷酸序列设计特异性引物，通过PCR反应能够在含有TMV抗性基因N的烟草中扩增出1条1200 bp左右的特征条带，并依据能否扩增出该特征条带来检测烟草品种是否具有TMV抗性[24]。Lewis等设计了N基因的特异性引物，并且用所设计的特异引物对12个抗烟草花叶病毒品种进行PCR扩增，12个抗TMV品种都能够扩增出目的条带[9]。张亮等设计了一系列N基因的特异性引物，有效地分辨出N基因缺失和含有N基因的烟草个体[25]。刘磊等根据N基因cDNA序列设计出4对引物，经过试验验证后所获得2对有效引物，通过对供试的11个烤烟品种进行PCR扩增，结果在4个烤烟品种中扩增出了目的条带，与已知的N基因在这11个烤烟品种中的分布结果一致，成功地建立了检测N基因的PCR扩增体系[14]。然而上述基于N基因开发的分子标记均是显性标记，无法一次性清晰地区分出材料中全部的三种基因型（抗病纯合基因型（NN）、感病纯合基因型（nn）和抗病杂合基因型（Nn））。本研究筛选获得的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的SSR标记TM508-007，能有效区分三种基因型（抗病纯合基因型（NN）、感病纯合基因型（nn）和抗病杂合基因型（Nn）），且具有稳定可靠且简易高效的特点。同时利用该标记的序列信息并结合Bindler等[22]公开发表的含有2363个位点的高质量烟草遗传图谱及中国烟草基因组数据库中红花大金元的基因组数据（数据尚未对外公开），最终将标记TM508-007分别定位在第11号连锁群的顶端和红花大金元基因组的第1号染色体上（约75.51 Mb处），在该处的1.18 Mb区域（75.42Mb-76.24Mb）内共发现了6个基因（其在红大基因组上的基因ID为：Ntab0849210、Ntab0849560、Ntab0849570、Ntab0849690、Ntab0849770和 Ntab0849780）， 其注释功能均与TMV抗性相关（基因注释：expressed protein, similar to TMV resistance protein）。

本研究利用回交一代（BC1F1）分离群体，采用分离群体分组分析（BSA）法和SSR标记技术，筛选获得共显性的SSR多态性标记TM508-007，经对123个BC1F1分离群体进行基因型分析验证，结果表明这种共显性多态均稳定存在，该共显性标记与目的基因N的遗传连锁距离为0.41 cM。由此推断，该标记与烟草TMV抗性基因N紧密连锁。

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：SU Yangmeng, TONG Zhijun, LI Meiyun , et al. Co-dominant SSR marker closely linked to TMV resistance gene N of tobacco(Nicotiana tobaccum L.) [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(2)

*Corresponding author.Email：liyongping@yntsti.com

Co-dominant SSR marker closely linked to TMV resistance gene N of tobacco(Nicotiana tobaccum L.)

SU Yangmeng1,2, TONG Zhijun2, LI Meiyun2, JIAO Fangchan2, GENG Suxiang3, LI Yongping2*
1 College of Biological Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding, National Tobacco Genetic Engineering Research Center, Kunming 650021, China;3 China Tobacco Shandong Industrial Co., Ltd., Jinan 250014, China

Tobacco mosaic virus (TMV) was one of the major diseases in tobacco (Nicotiana tabaccum L.) production. Separate progenies(BC1F1 population) from a cross between a resistant parent Coker176 and susceptible parent Y3 were used to establish TMV resistance gene N molecular marker-assisted selection system by bulked segregation analysis (BSA) method and simple sequence repeat (SSR)technology techniques. Among 18,764 SSR primer pairs, 396 SSR primers were polymorphic between parents, while only one SSR marker TM508-007 amplified products was closely linked to TMV-resistant gene N and the genetic distance between TM508-007 and gene N was 0.41 cm. The co-dominant SSR marker screened in this study enriched the number and types of molecular markers in terms of tobacco’s resistance to TMV, and they are expected to be used as marker-assisted selection in tobacco's resistance to TMV disease.

Tobacco (Nicotiana tabccum L.); tobacco mosaic virus (TMV); bulked segregation analysis (BSA); co-dominant SSR marker

粟阳萌，童治军，李梅云，等. 一个与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记[J]. 中国烟草学报，2017,23（2）

中国烟草总公司云南省公司科技项目（2016YN27）

粟阳萌（1991—），硕士研究生，研究方向为烟草遗传育种，Email：412404935@qq.com

李永平（1966—），研究员，主要从事烟草育种工作的研究，Email：liyongping@yntsti.com

2016-11-01；< class="emphasis_bold">网络出版时间：

时间：2017-03-23