王霖玲，曾健梅，阎优优，张博，林能明，#（.浙江中医药大学附属杭州第一医院转化医学研究中心，杭州30006；.杭州市第一人民医院/南京医科大学附属杭州医院转化医学研究中心，杭州30006）

土木香乙酸乙酯提取物对人胰腺癌Capan-2细胞增殖的抑制作用及机制研究Δ

王霖玲1＊，曾健梅1，阎优优2，张博2，林能明1，2#（1.浙江中医药大学附属杭州第一医院转化医学研究中心，杭州310006；2.杭州市第一人民医院/南京医科大学附属杭州医院转化医学研究中心，杭州310006）

目的：研究土木香乙酸乙酯提取物（IHE）对人胰腺癌Capan-2细胞增殖的抑制作用及机制。方法：采用MTT法测定0、0.5、1、2、4、8 μg/mL的IHE作用48 h后细胞的增殖抑制率，克隆形成试验观察0、1、2 μg/mL的IHE作用1周后对细胞克隆形成的影响，Hoechst 33342染色法观察0、2、4 μg/mL的IHE作用48 h后细胞核形态的变化，流式细胞术检测0、4、8、16 μg/mL的IHE作用48 h后细胞的凋亡率，JC-1染色法观察0、4、8、16 μg/mL的IHE作用24 h后细胞线粒体膜电位变化，Western blot法检测0、4、8、16 μg/mL的IHE作用48 h后细胞线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Mcl-1和p53上调凋亡因子（PUMA）、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）蛋白的表达。结果：2、4、8 μg/mL的IHE对细胞的增殖有明显抑制作用，且呈浓度依赖性，半数抑制浓度为6.6 μg/mL；1、2 μg/mL的IHE可明显抑制细胞的克隆形成；4 μg/mL的IHE可明显造成细胞核固缩；8、16 μg/mL的IHE可明显促进细胞凋亡，16μg/mL的IHE作用48 h后细胞凋亡率达到45.53%；16 μg/mL的IHE作用24 h后可引起82.47%的细胞线粒体膜电位下降；8 μg/mL的IHE可明显下调细胞中Bcl-2、Mcl-1、PUMA、PARP蛋白表达，16 μg/mL的IHE可明显下调细胞中Mcl-1、PUMA表达。结论：IHE可能通过引起细胞线粒体膜电位的下降，下调细胞中PUMA、Mcl-1蛋白的表达，引起细胞的凋亡，从而发挥其抑制人胰腺癌Capan-2细胞增殖的作用。

土木香；乙酸乙酯提取物；人胰腺癌Capan-2细胞；线粒体；细胞凋亡

胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，预计在2030年将成为病死率第二高的恶性肿瘤[1]。由于大多数胰腺癌患者确诊时已处于晚期，失去了手术机会，因此全身化疗对于晚期胰腺癌患者来说显得至关重要。尽管已有大量的研究致力于开发抗胰腺癌药物，但胰腺癌患者的5年生存率在过去40年没有明显提高，仍低于5%[2]。我国中药资源丰富，尚有许多具有抗肿瘤活性的天然药物仍处于开发阶段。土木香系菊科旋覆花属植物，为多年生草本，其根供药用，具有健胃、利尿和驱虫的功效[3]。有研究表明，土木香的醇提取物中富含倍半萜内酯类成分，而该类成分具有较强的抗肿瘤活性，对头颈部鳞状细胞癌、成胶质细胞瘤、前列腺癌等具有明显的细胞毒作用，但对胰腺癌的作用尚不明确[4]。本研究在获得土木香醇提取物的基础上[5-6]，进一步用乙酸乙酯萃取，得到了富含倍半萜内酯类成分的土木香乙酸乙酯提取物（Inula helenium ethyl acetate extract，IHE），并探讨IHE对人胰腺癌Capan-2细胞增殖的抑制作用及机制。

1 材料

1.1 仪器

FACSCantoⅡ型流式细胞仪（美国BD公司）；SpectraMax M3型全波长多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）；Microsystems CMS GmbH Am Friendensplatz 3型荧光显微镜（德国Leica公司）；ChemiDoc XRS+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 药品与试剂

RPMI 1640培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）、MTT（北京索莱宝科技有限公司）；荧光素异硫氰酸（FITC）标记的膜联蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒（美国BD公司，批号：6119908）；线粒体膜电位检测试剂盒（美国SAB公司，批号：H16）；Hoeschst 33258染色液（碧云天生物技术研究所）；兔源B细胞白血病2（Bcl-2）、Bax、p53上调凋亡因子（PUMA）、髓样细胞白血病1（Mcl-1）、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）单克隆抗体和鼠源β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（美国Abcam公司）；辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗（武汉艾美捷科技有限公司）；其余试剂均为分析纯。

1.3 细胞

人胰腺癌Capan-2细胞购于中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库，以含10%胎牛血清的RPMI 1640为培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养。

2 方法

2.1 IHE的提取

将10.0 kg干燥的土木香根茎磨成粗粉，95%乙醇浸泡48 h，在室温下用20倍的95%乙醇渗滤提取，真空浓缩，得到粗提物，约3.7 kg。将粗提物溶于1.5 L温水中，并用3倍量的乙酸乙酯（3×1.5 L）萃取后，减压蒸发，得到370.16 g的IHE（产率为3.7%）。用香草醛-硫酸比色法验证IHE中含有生物活性化合物[3]。临用时，用二甲基亚砜（DMSO）制备成高浓度母液后，用培养基稀释成不同质量浓度的IHE样品溶液。

2.2 MTT法检测细胞的增殖活性

收集对数生长期的Capan-2细胞，以离心半径为13.5 cm、1 000 r/min离心3 min，弃上清液，用培养基吹打成细胞悬液。然后分别以5×103个细胞/孔的密度接种于96孔板中，每孔100 μL，置于细胞培养箱中培养24 h，然后分别加入质量浓度分别为0（空白对照，含DMSO的培养液，下同）、1、2、4、8 μg/mL的IHE。作用48 h后，弃培养液，加入50 μL的MTT溶液，在细胞培养箱中继续孵育4 h后，离心去上清，每孔加入100 μL的DMSO，轻微振荡使蓝色结晶完全溶解。用全波长多功能酶标仪测每孔的光密度（OD），检测波长为570 nm，参照波长为650 nm。试验重复3次，每次设定5个平行复孔。细胞增殖抑制率（%）＝（1－给药孔OD均值/空白对照孔OD均值）×100%。使用GraphPad Prism 5软件计算半数抑制浓度（IC50）。

2.3 克隆形成试验检测细胞的克隆形成能力

收集对数生长期的Capan-2细胞，计数，以500个细胞/孔的细胞密度接种于6孔板中，置于细胞培养箱中培养72 h后，加入0（空白对照）、1、2 μg/mL的IHE，置于培养箱中培养1周。取出，弃去原培养液，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍，然后用4%的多聚甲醛固定20 min，用吉姆萨（Giemsa）染液染色20 min。PBS洗干净后晾干，拍照观察细胞集落形成数量。试验重复3次。

2.4 Hoechst 33342染色试验观察细胞核形态变化

收集对数生长期的Capan-2细胞，以2×104个细胞/孔的密度接种于24孔板中，置于培养箱中培养24 h后，加入0（空白对照）、2、4 μg/mL的IHE，培养48 h。弃原培养液，用PBS洗2遍，然后每孔加入1 mL的4%多聚甲醛固定20 min。用PBS洗2遍后，再每孔加入300 μL的Hoechst 33342荧光染色液，于细胞培养箱中培养20 min。取出后弃培养液，PBS洗2遍，用荧光显微镜观察细胞核变化，并拍照记录。试验重复3次。

2.5 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞的凋亡情况

收集对数生长期的Capan-2细胞，以2×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，将细胞置于培养箱中培养24 h后，加入0（空白对照）、4、8、16 μg/mL的IHE培养48 h，收集上清培养液，用胰酶消化细胞并收集。之后加入300 μL的AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒中的缓冲液、5 μL的AnnexinⅤ-FITC染液，轻轻混匀后，于2～8℃避光条件下培养15 min。再加入10 μL的PI，轻轻混匀，于2～8℃避光条件下培养5 min后，流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率（%）。试验重复3次。

2.6 JC-1染色法检测细胞内线粒体膜电位

收集对数生长期的Capan-2细胞，以2×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，将细胞置于培养箱中培养24 h后，加入0（空白对照）、4、8、16 μg/mL的IHE培养24 h。收集上清培养液，用胰酶消化并收集细胞，然后用PBS洗2遍。每个样本加入500 μL的JC-1工作液，于细胞培养箱中培养15 min后，用流式细胞仪检测膜电位下降细胞比例。试验重复3次。

2.7 Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白的表达

收集对数生长期的Capan-2细胞，分别加入0（空白对照）、4、8、16 μg/mL的IHE培养48 h后，采用细胞裂解液收集细胞。二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒测定总蛋白浓度，将样品调整至等浓度后分装，－80℃保存。以β-actin为内参进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。用50 g/L的脱脂奶粉溶液室温封闭1 h后，分别加入1∶1 000稀释的一抗（Bcl-2、Bax、Mcl-1、PUMA、PARP、β-actin），4℃孵育过夜，用缓冲液TBST洗膜3次，每次10 min。然后加入HRP标记的二抗（1∶5 000），于室温条件下培养2 h，再用缓冲液TBST洗膜3次，每次10 min。用超敏化学发光试剂显影检测，应用化学发光成像仪进行图像采集，以目标蛋白条带的灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。试验重复3次。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 IHE对Capan-2细胞体外增殖的影响

IHE对细胞的增殖抑制率呈明显的浓度依赖性增加。与0µg/mL比较，2、4、8 μg/mL的IHE作用48 h后细胞的增殖抑制率均明显升高（P＜0.05或P＜0.01），其中8 μg/mL的IHE对Capan-2的抑制率超过了80%。1、2、4、8 μg/mL的IHE作用48 h后，细胞的增殖抑制率分别为（7.01±1.84）%、（12.39±3.84）%、（38.23±3.30）%、（80.83±1.37）%（n＝3），IC50为6.6 μg/mL。

3.2 IHE对Capan-2细胞克隆形成的影响

克隆形成试验也表明，不同质量浓度IHE对Capan-2细胞的增殖有不同程度的抑制作用。经Giemsa染色后可看出，IHE作用于细胞1周后，随着其质量浓度的增加，细胞集落形成数逐渐减少。与0 μg/mL比较，2 μg/mL的IHE作用1周后细胞集落形成数明显减少（P＜0.01）。0、1、2 μg/mL的IHE作用1周后细胞集落形成数分别为（362.67±17.90）、（234.67±17.79）、（74.33±6.11）个（n＝3）。

3.3 IHE对Capan-2细胞核的影响

以2、4 μg/mL的IHE作用于细胞48 h后，细胞核固缩，荧光强度显著增加，且4 μg/mL的IHE作用较2 μg/mL明显。这一结果也证实了IHE能抑制Capan-2细胞的增殖，染色后荧光显微图见图1。

图1 不同质量浓度IHE作用48 h后细胞核的荧光显微图（Hoechst 33342染色，×40）Fig1 Fluorescence micrographs of nuclear morphology after 48 h with different mass concentrations of IHE（Hoechst 33342 staining，×40）

3.4 IHE对Capan-2细胞凋亡的影响

4、8、16 μg/mL的IHE作用于细胞48 h后，细胞凋亡率均不同程度升高，且呈明显的浓度依赖性。与0 μg/mL比较，8、16 μg/mL的IHE作用后细胞凋亡率均明显升高（P＜0.01）。0、4、8、16 μg/mL的IHE作用48 h后细胞的凋亡率依次为（8.43±2.47）%、（12.87±4.52）%、（23.97±3.24）%、（40.60±8.27）%（n＝3），流式图见图2。

图2 不同质量浓度IHE作用48 h后细胞凋亡的流式图Fig2 Flow cytometry charts of cell apoptosis after 48 h with different mass concentrations of IHE

3.5 IHE对细胞线粒体膜电位的影响

4、8、16 μg/mL的IHE作用于细胞24 h后，均可不同程度地降低细胞线粒体膜电位，且呈明显的浓度依赖性。与0 μg/mL比较，16 μg/mL的IHE作用后线粒体膜电位下降细胞比例为（82.47±1.25）%（P＜0.01）。0、4、8、16 μg/mL的IHE作用24 h后线粒体膜电位下降的细胞比例依次为（3.8±0.61）%、（10.87±0.83）%、（19.2±1.01）%、（82.47±1.25）%，结果见图3。

图3 不同质量浓度IHE作用24 h后细胞线粒体膜电位的流式图Fig3 Flow cytometry charts of mitochondria membrane potential after 24 h with different mass concentrations of IHE

3.6 IHE对细胞线粒体凋亡相关蛋白表达的影响

与0 μg/mL比较，8 μg/mL的IHE作用于细胞48 h后，细胞中Bcl-2、Mcl-1、PUMA、PARP蛋白表达明显减弱（P＜0.05或P＜0.01）；16 μg/mL的IHE作用于细胞48 h后，细胞中PUMA、Mcl-1蛋白表达明显减弱（P＜0.01）。蛋白表达电泳结果见图4、测定结果见表2。

图4 不同质量浓度IHE作用48 h后细胞线粒体凋亡相关蛋白的电泳图Fig4 Electrophoresis charts of mitochondrial apoptosis-related proteins after 48 h with different mass concentrations of IHE

4 讨论

在本研究中，笔者采用了不同方法来验证IHE对胰腺癌Capan-2细胞有增殖抑制作用，包括MTT试验、克隆形成试验和细胞核荧光染色试验。在进行克隆形成试验时，因作用时间较长，药物浓度应低于IC50，故笔者采用了0、1、2 μg/mL的IHE进行试验。在MTT预试验中，笔者设置了0、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL的等浓度梯度，结果当IHE质量浓度为8 μg/mL时细胞的增殖抑制作用已经达到峰值，故正式试验时IHE的质量浓度设置为0、0.5、1、2、4、8 μg/mL。

表2 不同质量浓度IHE作用48 h后细胞线粒体凋亡相关蛋白的测定结果（±s，n＝3）Tab2 Determination results of mitochondrial apoptosis-related proteins after 48 h with different mass concentrations of IHE（±s，n＝3）

表2 不同质量浓度IHE作用48 h后细胞线粒体凋亡相关蛋白的测定结果（±s，n＝3）Tab2 Determination results of mitochondrial apoptosis-related proteins after 48 h with different mass concentrations of IHE（±s，n＝3）

注：与0 μg/mL比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.0 μg/mL，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

PARP/β-actin 0.77±0.01 0.66±0.01 0.31±0.02＊0.78±0.01 IHE质量浓度，μg/mL 0481 6 Bax/β-actin 1.41±0.02 1.27±0.01 1.26±0.02 1.28±0.03 Bcl-2/β-actin 0.82±0.03 0.58±0.01 0.41±0.02＊0.98±0.03 Mcl-1/β-actin 1.48±0.08 0.51±0.02 0.17±0.01＊＊0.08±0.01＊＊PUMA/β-actin 1.01±0.03 0.63±0.01 0.23±0.01＊＊0.28±0.03＊＊

JC-1是一种阳离子染料，可以检测细胞线粒体膜电位的变化。当细胞线粒体膜电位较高时，JC-1能聚集在线粒体基质中，形成聚合物，产生红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集，以单体存在，此时产生绿色荧光[7]。当JC-1从红色荧光到绿色荧光转变时可以反映出线粒体膜电位的下降，而线粒体膜电位下降则是细胞早期凋亡的一个重要标志。线粒体膜电位下降后可以促使线粒体释放细胞色素C[8]，细胞色素C与凋亡酶激活因子（Apaf-1）结合后能够催化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Caspase-9）的活化，最终使下游Caspase-3活化而诱导细胞凋亡[9]。PARP作为细胞凋亡核心成员Caspase水解的切割底物，其在DNA损伤修复和细胞凋亡中发挥着重要作用。PARP在体内是Caspase-3的主要切割对象，被剪切后PARP的羧基端的催化结构域（89 kD）和氨基端的DNA结合结构域（24 kD）分离，使其失去酶活力，其裂解片段的出现被认为是细胞凋亡的重要信号[7]。Bcl-2家族蛋白成员是线粒体凋亡通路的重要调节因子，如Bak、Bax等可以促进细胞凋亡，Bcl-2、Mcl-1等可以抑制细胞凋亡，另外还有一些BH3-only蛋白（如NOXA、PUMA等）也可促进细胞凋亡。

本研究结果显示，Capan-2细胞经IHE处理后，随着IHE质量浓度的增加细胞线粒体膜电位明显下降，细胞凋亡率明显升高。此外，从Western blot的结果也可以看到，抑凋亡蛋白Mcl-1的表达随着IHE质量浓度的增加而减弱；而Bcl-2的表达也随着IHE质量浓度的增加而减弱，但在高质量浓度（16 μg/mL）IHE的作用下则有反馈性的上调；而促凋亡蛋白Bax则无明显变化。BH3-only蛋白PUMA的表达也随着IHE质量浓度的增加而减弱。PARP在高质量浓度IHE处理后出现裂解片段。本研究结果表明，IHE可能是通过引起线粒体膜电位的下降，从而引起胰腺癌Capan-2细胞的凋亡。

综上所述，IHE对人胰腺癌Capan-2细胞具有较强的体外增殖抑制作用。其作用机制可能是通过引起线粒体膜电位的下降，下调细胞中Mcl-1、PUMA蛋白的表达，从而引起胰腺癌细胞的凋亡。

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Study on the Inhibitory Effect and Mechanism of Inula helenium Ethyl Acetate Extract on Proliferation of Human Pancreatic Cancer Capan-2 Cells

WANG Linling1，ZENG Jianmei1，YAN Youyou2，ZHANG Bo2，LIN Nengming1，2（1.Transformational Medicine Research Center，Hangzhou First Hospital Affiliated to Zhejiang University of TCM，Hangzhou 310006，China；2.Transformational Medicine Research Center，Hangzhou First People’s Hospital/Hangzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Hangzhou，310006，China）

OBJECTIVE：To study the inhibitory effect and mechanism of Inula helenium ethyl acetate extract（IHE）on proliferation of human pancreatic cancer Capan-2 cells.METHODS：MTT was used to determine the cell proliferation inhibition rate after treated by 0，0.5，1，2，4，8 μg/mL IHE；clone formation test was used to observe the effects of 0，1，2 μg/mL IHE treating for 1 week on cell clone formation；Hoechest 33342 staining was used to observe the changes of nuclear morphology after treated by 0，2，4 μg/mL IHE for 48 h；flow cytometry was used to detect the cell apoptosis rate after treated by 0，4，8，16 μg/mL IHE for 48 h；JC-1 staining was used to observe the changes of intracellular mitochondrial membrane potential after treated by 0，4，8，16 μg/mL IHE for 24 h；Western blot was used to detect the expressions of mitochondrial apoptosis-related proteins Bcl-2，Bax，Mcl-1，p53 upregulated modulator of apoptosis（PUMA），and polymerase（PARP）after treated by 0，4，8，16 μg/mL IHE for 48 h.RESULTS：2，4，8 μg/mL IHE had obvious inhibitory effect on cell proliferation，showing concentration-dependent relationship，with IC50of 6.6 μg/mL；1，2 μg/mL IHE can obviously inhibit the clone formation of cells；4 μg/mL IHE can obviously cause cell nuclear condensation；8，16 μg/mL IHE can obviously promote the cell apoptosis，and the cell apoptosis rate reached 45.53%after treated by 16 μg/mL IHE for 48 h；16 μg/mL IHE treating for 24 h can cause the decrease of 82.47%cells’mitochondrial membrane potential；8 μg/mL IHE can obviously down-regulate the protein expressions of Bcl-2，Mcl-1，PUMA and PARP，and 16 μg/mL IHE can obviously down-regulate the expressions of Mcl-1 and PUMA.CONCLUSIONS：IHE may show its inhibitory effect on proliferation of human pancreatic cancer Capan-2 cells by causing the decrease of mitochondrial membrane potential in cells and down-regulating the protein expressions of Mcl-1 and PUMA to cause cell apoptosis.KEYWORDSInula helenium；Ethyl acetate extract；Human pancreatic cancer Capan-2 cells；Mitochondrion；Cell apoptosis

R285.5

A

1001-0408（2017）31-4384-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.17

浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目（No.2010-190-4）

＊硕士研究生。研究方向：肿瘤药理学。电话：0571-56007664。E-mail：sweetyling@126.com

#通信作者：教授，主任药师，博士生导师。研究方向：临床药理学、临床毒理学。电话：0571-56007809。E-mail：lnm1013@163.com

2017-02-09

2017-08-10）

（编辑：林静）