李志峰　陈勇　童仲驰

摘要：目的 研究CD164在胶质瘤组织及细胞系中的表达，以及对体外胶质瘤细胞增殖的作用。方法 采用qRT-PCR分析CD164在45例胶质瘤组织和正常脑组织中的表达，利用western blot检测CD164在人胶质瘤细胞株SF295、SHG-44、U87和U251以及人正常星形胶质细胞系NHA中的表达；构建沉默CD164的慢病毒载体，并将其感染至胶质瘤细胞株U251，CCK-8法检测细胞增殖；western blot法检测感染CD164 shRNA后对U251细胞中PTEN蛋白表达的影响。结果 CD164在胶质瘤组织的表达较正常脑组织显著上调，差异有统计学（P<0.001）；与NHA细胞相比较，CD164在人胶质瘤细胞系SF295、SHG-44、U87和U251细胞中的表达量明显增加，具有明显的统计学差异性（P<0.001）；U251细胞感染CD164 shRNA后，细胞存活率较阴性对照组下降，两组结果存在明显的统计学差异（P<0.001）；感染CD164 shRNA至U251细胞后PTEN蛋白表达水平明显升高。结论 CD164可能通过调控PTEN的表达从而影响胶质瘤细胞增殖。

关键词：胶质瘤；CD164；PTEN；增殖

中图分类号：R739.41 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）22-0029-04

Abstract：Objective To investigate the expression of CD164 in glioma tissues and cell lines，and the effects on glioma cell proliferation in vitro. Methods The expression of qRT-PCR of CD164 in 45 cases of glioma tissues and normal brain tissues，using western blot to detect CD164 in the human glioma cell lines SF295，SHG-44，U87 and U251 and the expression of the normal astrocyte cell line NHA；lentiviral vector construction of CD164 silencing，and the infection to U251 glioma cell line，cell proliferation was detected by CCK-8；CD164 shRNA western blot infection detection method of U251 cells PTEN protein expression.Results The expression of CD164 in glioma compared with normal brain tissue the organization was significantly increased，the difference was statistically（P<0.001）；compared with NHA cells，CD164 in human glioma cell lines SF295，SHG-44， expression of U87 and U251 cells increased significantly，a statistically significant difference（P<0.001）；U251 cells infected with CD164 shRNA，the cell survival rate decreased compared with negative control group，there were statistically significant differences between the results of the two groups（P<0.001）；the expression level of PTEN protein was significantly increased CD164 shRNA infection to U251 cells.Conclusion CD164 may affect the proliferation of glioma cells by expression the regulation of PTEN.

Key words：Glioma；CD164；PTEN；Proliferation

胶质瘤也被成为胶质细胞瘤，是最常见的神经系统恶性肿瘤，其发病率占所有颅内肿瘤的30%～40%，2015年美国大约有20000胶质瘤新发病例，同时胶质瘤在青少年人群中的发病率呈逐年上升的态势[1]。近年来，随着对胶质瘤基因分析研究的不断深入，针对胶质瘤的诸如免疫治疗和基因治疗等多种新型治疗方式不断涌现，有望更进一步改善胶质瘤患者预后[2]。CD164作为一种定位于6号染色体的唾液酸黏蛋白[3]。研究表明CD164在机体造血和调节正常细胞生长分化过程中发挥一定调控作用；同时CD164在调节恶性肿瘤细胞生长、凋亡和侵袭性行为中也发挥了一定作用；CD164已经被证实在结肠癌、宫颈癌和成神经管细胞瘤等实体肿瘤发生和发展过程中发挥着重要作用[4-5]；最新研究结果表明CD164可作为急性成淋巴细胞性白血病中分子生物学标记[6]。目前CD164与人脑胶质瘤的相关性研究尚未见报道，为此，本研究拟探讨CD164对人脑胶质瘤细胞生长的作用，并探讨其可能作用机制。

1材料与方法

1.1组织标本

收集岳阳市第二人民医院神经外科在2012年6月～2014年6月收治的45例脑胶质瘤患者的临床标本，男22例，女23例，年龄48.9～71.2岁，平均年龄（58.6±6.4）岁，另外设立5例脑损伤患者正常脑组织标本作为对照。所有纳入本次队列的患者均经过2位经验丰富的病理科专家分别确诊为胶质瘤，且所有患者均未接受新辅助治疗。其他排除标准包括下咽困難、急慢性感染、充血性心力衰竭、COPD和肝硬化。endprint

1.2 mRNA的提取及检测

mRNA的提取实验步骤严格按照miRNA提取试剂盒操作步骤进行。CD164上游引物序列为：5′- GCTTCGCCAATTTGGGGTTG -3′，下游引物序列为5′-TATCCATCATTGTCGAATGTGT-3′，内参U6上游引物序列为：5′- CCTCTTAGATCACTATGGCAG-3′，下游引物序列为5′- GTTATTGAGCCATGGTTCGG-3′。依照PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒根据制造商的指示，cDNA经反转录生成。对mRNA进行定量分析检测步骤如下：95 °C温度下2 min，然后在95 °C温度下反应45 s和60 °C温度下反应60 s，持续30个循环，每个样本检测3次，通过2-△△Ct的方法计算CD164 mRNA的相对表达差异倍数，实验重复3次。

1.3试剂

Opti-MEM培养基、DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司； Trizol试剂和Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；shRNA NC和CD164 shRNA购自中国GenePharma；miRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、RT-PCR 试剂盒和细胞蛋白提取试剂盒购自日本TaKaRa株式会社；CCK-8试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；PTEN和β-actin抗体购自美国Epitomics公司。

1.4细胞培养

人胚肾细胞株HEK-293T、胶质瘤细胞株SF295、SHG-44、U251和U251及人正常胶质细胞NHA细胞均由上海细胞生物研究所提供。细胞培养于DMEM培养基中，培养基中补充10%胎牛血清、青霉素（100 U/μl）和链霉素（100 μg/ml）。细胞在37 ℃且CO2 含量约为5%的细胞培养箱内进行培养。当细胞生长至占培养瓶底面积90%以上时用胰蛋白酶消化并用于实验。

1.5 构建慢病毒载体感染U251细胞及筛选

依照文献提供的CD164 shRNA有效靶序列设计并构建3条干扰序列及阴性对照序列，并筛选出一条最有效的干扰序列[7]，根据Lipofectamine2000制造商的指示将最优干扰序列的慢病毒表达载体经Lipofectamine2000转染至HEK-293T细胞中，收集病毒上清液离心并测定病毒滴度后感染SW480细胞，将病毒液感染细胞12 h后更换含10%胎牛血清的培养基，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白荧光，流式细胞仪检测感染效率。

1.6 将CD164 shRNA及shRNA NC感染至U251细胞

将对数生长期的U251细胞接种于24孔板中，每孔2×105个细胞，将5 μl浓度为20 μmol/L的CD164 shRNA与5 μl感染试剂lipofeetamine 2000混匀后加入细胞中，CD164 shRNA的感染终浓度为100 nmol/L，将培养板置于细胞培养箱中孵育48 h后进行相关功能性和western blot等检测。shRNA NC的感染方法同CD164 shRNA的感染。

1.7 CCK-8法检测细胞增殖

将U251细胞以每孔5×103个播种至96孔板中。在每个培养孔中添加完全培养基至100 μl在37 ℃含5%CO2细胞培养箱中至细胞融合，每孔添加CCK-8溶液（0.01 ml每孔）反应1 h，用酶标仪测定490 nm波长处吸光度值（A490），实验重复5次，取平均值。

1.8 Western blot检测细胞中蛋白的表达

U251细胞在冰冷的PBS液中洗涤三次后重悬于细胞裂解液（100 μL/孔）中。当细胞裂片至于冰上反应30 min，再在4 °C温度下12000 g离心20 min，收集上清后使用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白质浓度进行定量分析。蛋白质样品（30μg）使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行后转移到0.45 μm的硝酸纤维素膜上，并使用5%脱脂奶粉于4 ℃下孵育过夜，该膜在4 °C与一抗在室温下反应30 min后，在室温下与二抗再次孵育1 h。以内参β-actin蛋白条带灰度值的比值来校正母的蛋白的光密度值。

1.9统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析，数据均以（x±s）来表现，使用t检验和方差分析对所得样本数据进行统计学分析，统计学意义校正值设定为P<0.05。

2结果

2.1 CD164在胶质瘤组织中的表达

根据2007年WHO胶质瘤分类标准将纳入本组队列的45例病例进行分类，这45例胶质瘤患者临床病理学信息见表1。qRP-PCR检测结果表明，与正常脑组织正常组织相比较，CD164在胶质瘤组织中的表达显著上调（3.15±0.63 vs. 0.53±0.12），有统计学显著性（P<0.001）。

2.2 CD164对体外胶质瘤细胞增殖的影响

western blot實验检测结果表明，CD164在人正常胶质细胞NHA中的表达量较低，而在人胶质瘤细胞株SF295、SHG-44、U87和U251中表达明显升高，差异有统计学意义（F=56.84， P<0.001）；同时与SF295、SHG-44和U87细胞相比较，U251细胞中CD164表达量明显升高（P<0.001），后续试验选择U251细胞作为实验对象，见图1。

分别将CD164 shRNA或shRNA NC感染进入U251细胞72 h后，利用western blot检测U251细胞中的感染情况，结果表明细胞感染CD164 shRNA可显著下调CD164在U251细胞中的表达，差异有统计学意义（P<0.001），而感染shRNA NC对CD164的相对表达量无明显影响（图1B）。而U251细胞感染CD164 shRNA后经CCK-8法检测细胞A490值为0.455±0.073，较阴性对照组（0.742±0.084）明显降低，差异有统计学显著性（t=8.563， P=0.013）。endprint

2.3 CD164对体外胶质瘤细胞中PTEN表达的影响

为研究CD164影响胶质瘤细胞增殖的作用机制，本研究检测了下调CD164后对U251细胞中PTEN蛋白的影响。western blot结果表明，与阴性对照组相比较，U251细胞经感染shRNA CD164后可显著上调U251细胞中PTEN蛋白的表达，而shRNA NC对U251细胞中PTEN的表达无明显影响（图2）。

3讨论

本研究中，我们首先检测了45例胶质瘤组织和正常脑组织中CD164的表达情况，结果显示，CD164在胶质瘤组织中的表达水平明显高于正常脑组织，提示CD164在胶质瘤发生的早期阶段可能充当着癌基因的作用，同时CD164在体外胶质瘤细胞株中的表达也高于正常胶质细胞中的表达，这种CD164在良恶性组织及细胞中的表达差异表明CD164与胶质瘤细胞的发生和发展可能存在一定的关联。为进一步研究其在胶质瘤恶性生物学行为中的作用，本研究通过RNA干扰技术沉默CD164在体外胶质瘤细胞中的表达，经流式细胞术证实成功構建稳定沉默CD164表达的U251细胞株，同时CCK-8实验结果表明沉默CD164后可抑制体外胶质瘤细胞增殖，表明CD164在调控胶质瘤细胞增殖中发挥了一定作用。

PTEN作为一个位于染色体10q23.3上的基因，也是在人类肿瘤中继p53基因之后发现的最易发生变异的基因。PTEN基因在人体正常组织细胞中呈高表达，其正常表达参与了蛋白质和酯类底物酪氨酸、丝/苏氨酸磷酸化的调节过程，在细胞周期调节、增殖、凋亡和侵袭等生理活动中发挥广泛的调控作用[7-8]。而PTEN基因突变或缺失及蛋白表达异常可促进细胞增生并抑制细胞凋亡，PTEN在恶性肿瘤中的表达与肿瘤TNM分期呈负相关，同时PTEN的低表达与乳腺癌化疗耐药密切相关[9-11]。同时PTEN的缺失或低表达可抑制PI3K激酶活性，使PIP3去磷酸化，引起PIP3催化亚基的表达放大而导致AKT磷酸化，从而在恶性肿瘤细胞增殖、凋亡、蛋白合成和转移等多种生理活动中发挥重要作用，这是PTEN调节肿瘤细胞增殖和凋亡的重要作用机制，既往研究表明，抑制PTEN/PI3K/AKT 通路的激活可有效抑制恶性肿瘤细胞增殖和转移[12]。在本研究中，笔者观察到沉默CD164在体外胶质瘤细胞中的表达后可诱导PTEN在细胞中的表达，因此笔者猜想CD164可能通过调控PTEN的表达从而影响体外胶质瘤细胞增殖。

综上所述，本研究表明CD164可负向调控PTEN的表达从而影响体外胶质瘤细胞增殖，但CD164是否对体内胶质瘤同样具有调节增殖能力尚未可知，同时虽然证实CD164与PTEN在体外胶质瘤细胞中存在一定联系，但CD164与PTEN之间是直接调控还是间接调控仍需进一步实验明确。但本次研究为临床胶质瘤基因治疗提供一个新的作用靶点，在揭示胶质瘤的发病机制及治疗上具有一定积极意义。

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編辑/李桦endprint