张智，李晴，化洪苓，尹文哲，李杰，马建章，*

（1.东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040；2.哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150086；3.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）

橡子粉低聚异麦芽糖功能性实验分析

张智1，李晴1，化洪苓1，尹文哲2，李杰3，马建章1，*

（1.东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040；2.哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150086；3.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）

初步探究橡子粉低聚异麦芽糖的促双歧杆菌增殖功能及润肠通便功效。以橡子粉低聚异麦芽糖取代葡萄糖为碳源添加到双歧杆菌MRS培养基中，进行增殖实验及生长曲线的比较；对小鼠建立便秘模型组、空白对照组及低、中、高3个剂量组并进行小鼠排便实验及小肠推进实验。结果表明，橡子粉低聚异麦芽糖对青春双歧杆菌具有良好的体外促增殖作用。随着橡子粉低聚异麦芽糖添加浓度的增加，活菌数增加。当橡子粉低聚异麦芽糖替代葡萄糖且浓度为1.5%时，培养24 h后，青春双歧杆菌活菌数为（7.22±0.15）%，达到最大生长量，且使青春双歧杆菌提前进入稳定生长期；低、中、高剂量的橡子粉低聚异麦芽糖均能改善便秘小鼠润肠通便的功能，其中，中剂量的橡子粉低聚异麦芽糖效果较好。说明橡子粉低聚异麦芽糖有良好的促双歧杆菌增殖功能及润肠通便功效。

橡子粉低聚异麦芽糖；双歧杆菌；促增殖作用；润肠通便

橡子（acorn），为麻栎属橡树和常绿槠栲类橡树所结果实，我国橡子资源丰富，约有7属300多种[1]。橡子仁营养丰富，其中含有淀粉约50.6%~58.7%、蛋白质11.7%~15.8%、脂肪 2.1%~2.8%、单宁 10.2%~14.1%[2]。目前利用橡子粉制备低聚异麦芽糖的相关研究尚未发现。

双歧杆菌（Bifidobacterium）是一种人体肠道中的益生菌，有着增强营养、延缓衰老、抗肿瘤、抑制内毒素、维持肠道正常菌群平衡，增强机体抵抗力等的特殊功能[3-6]。本文所用的橡子粉低聚异麦芽糖为酶法制备，低聚异麦芽糖的主要成分是异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖，作为功能性低聚糖，是双歧杆菌的有效增殖因子，能够使双歧杆菌大量增殖[7]。关于低聚糖作为益生元对双歧杆菌的增殖作用已有诸多研究，例如魔芋低聚糖[8]、金丝小枣低聚糖[9]等的相关研究。但关于橡子粉制取的低聚异麦芽糖增殖双歧杆菌的研究鲜见报道。

由于低聚异麦芽糖可以促进肠道的菌群平衡，因此低聚异麦芽糖有着润肠通便的功效。目前已有很多关于低聚糖润肠通便功能的研究，如郑学玲等[10]通过对小鼠的排便实验及小肠推进功能实验研究发现小麦麸皮戊聚糖有显著的润肠通便功能，周慧等[11]通过复方地芬诺酯建立小鼠药物便秘模型组，同时建立麻仁丸阳性对照组、空白对照组，验证了大米低聚异麦芽糖的润肠通便功效。

本文以酶法制备的橡子粉低聚异麦芽糖为研究对象，分别对青春双歧杆菌进行体外促双歧杆菌增殖实验，对小鼠进行体内润肠通便功能实验，研究分析橡子粉低聚异麦芽糖的促双歧杆菌增殖功能及其润肠通便功效，为其应用于食品研究中提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 体外促双歧杆菌增殖实验

1.1.1 实验菌株

青春双歧杆菌：ATCC，哈尔滨美华有限公司。

1.1.2 材料、仪器及试剂

橡子粉：抚顺金宇食品有限公司；酵母粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨：天津天力化学试剂有限公司。

YQX-Ⅱ厌氧培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-1G单人单面（水平）净化工作台：江苏通净净化设备有限公司；ZHWY-2102C恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；YXQ-LS-18SI手提式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；PHS-3 pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；722s可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.1.3 培养基

1）脱脂乳培养基：称取低脂乳12 g，加入100 mL的蒸馏水中，然后在电炉连续煮沸2次～3次去乳皮脱脂，用于菌种的活化，115℃灭菌15 min后冷却备用；（2）MRS培养基：蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，柠檬酸二铵2 g，吐温80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，加蒸馏水定容到1 000 mL，灭菌前pH值调至6.2~6.4，置于电炉上加热溶解，将配好的培养基置于锥形瓶中，121℃灭菌15 min[12]。固体培养基另加入20 g琼脂。

1.1.4 菌种活化

称取一定量的青春双歧杆菌的菌粉溶解于100 mL脱脂乳培养基中，充分混匀，（37±1）℃恒温静置培养24 h，然后1%的接种量继续传代培养。活化后，传代3次，于厌氧管中厌氧培养48 h~72 h，挑取菌落形态较大、乳白色、湿润、周边圆滑的菌落，相差显微镜观察形态，重复3次，菌落形态一致后，再活化两次，作为实验菌株。

1.1.5 平板菌落计数

样液采用10倍梯度稀释，选取适当稀释度倾注平板，使其均匀分布于培养基中，37℃厌氧培养48 h后计数菌落数目。

1.1.6 增殖实验

以不同剂量橡子粉低聚异麦芽糖代替葡萄糖作为MRS培养基碳源，添加浓度分别为0%、0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%，于（37±1）℃厌氧静置培养，24 h后取出，测定其活菌数[13]。以葡萄糖为碳源的MRS培养基为对照组，比较不同浓度橡子粉低聚异麦芽糖对青春双歧杆菌的增殖效果。

1.1.7 生长曲线

通过1.1.6试验，确定橡子粉低聚异麦芽糖作为碳源在MRS培养基中最适添加比例。按1%接种量，将活化好菌液接种到已灭菌的以橡子粉低聚异麦芽糖为碳源的MRS液体培养基中，静置培养48 h，每隔4 h从三角瓶中吸取0.1 mL发酵液，采用平板计数法，测定培养基中的活菌数，以葡萄糖基础培养基为对照，研究橡子粉低聚异麦芽糖对青春双歧杆菌生长曲线的影响。

1.2 体内润肠通便功能实验

1.2.1 实验动物

选取雄性小鼠90只，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（黑）2013-004，体重19 g~21 g。小鼠按清洁级动物饲养，自由进食，饮洁净水，保持实验室环境卫生，温度18℃～20℃，相对湿度50%～60%，通风良好，分笼喂养。

1.2.2 材料及试剂

生理盐水（250 mL：2.25 g）：哈尔滨三联药业有限公司；复方地芬诺酯片（药品级）：吉林万通药业集团；活性炭粉、阿拉伯树胶（AR）：天津市致远科技有限公司。

1.2.3 实验动物的安排

实验小鼠分为5组，每组18只，共90只。

A组（空白对照组）：以蒸馏水灌胃；B组（便秘模型对照组）：以复方地芬诺酯灌胃；A组和B组小鼠每天灌胃蒸馏水0.2 mL/只；C、D、E组分别为橡子粉低聚异麦芽糖低、中、高3个剂量组，按体质量计算，剂量组的小鼠每天分别灌胃约0.03、0.3、3.0 g/kg·bw的橡子粉低聚异麦芽糖溶液0.2 mL/只，实验期间自由进食[14]。

1.2.4 小鼠排便实验

在连续喂养20 d后，各组取9只小鼠禁食24 h，饮用水正常供应，除空白对照组外，其余各组灌胃复方地酚诺酯50 mg/kg·bw，将小鼠放入笼中单独喂养，正常饮水进食，1 h后，各剂量组灌胃一次受试物，然后各组小鼠灌胃15%碳黑水作为标记物，观察记录每只小鼠自灌胃碳黑水起至首次排出黑便所需时间，以及8 h内排便粒数及排便重量。

1.2.5 小肠推进实验

连续给予受试物20 d后，各组剩余小鼠禁食24 h，除空白对照组外，其余各组灌胃复方地酚诺酯50 mg/kg·bw，20 min后各组小鼠灌胃15%碳黑水（阿拉伯树胶与活性炭粉末的质量之比为2∶1）[10]，20 min后用颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管平铺成直线，测量小肠全长和由幽门至墨水前沿距离，计算小肠推进率，计算公式如下[15-16]：

1.3 橡子粉低聚异麦芽糖的制备

1.4 数据分析

所有进行实验均平行3次，数据表示为：结果±标准差，分析软件为SPSS 17.0。

2 结果与讨论

2.1 体外促双歧杆菌增殖实验

2.1.1 增殖实验

不同浓度橡子粉低聚异麦芽糖浓度对青春双歧杆菌体外增殖的影响见图1。

图1 不同浓度橡子粉低聚异麦芽糖浓度对青春双歧杆菌体外增殖的影响Fig.1 Effect of different level of acorn starch isomalto-oligosaccharide on the viable count of Bifidobacterium adolescentis in vitro

由图1可以看出，橡子粉低聚异麦芽糖的浓度在培养基中为1.50%时，培养24 h后，与对照组呈显著性差异（p＜0.05）。这说明橡子粉低聚异麦芽糖作为碳源对双歧杆菌进行增殖的能力优于葡萄糖。

但是，橡子粉低聚异麦芽糖浓度增加到2%时，双歧杆菌的生长没有呈现继续增加的趋势，可能是低聚异麦芽糖浓度进一步提高导致渗透压增加，对其有一定脱水作用，抑制了双歧杆菌的进一步生长增殖，说明橡子粉低聚异麦芽糖对益生菌的促生长作用表现在一定的浓度范围以内。

2.1.2 生长曲线

青春双歧杆菌生长曲线见图2。

图2 青春双歧杆菌生长曲线（不同碳源）Fig.2 The growth curve of Bifidobacterium adolescentis（different carbon source）

选用1.5%浓度的橡子粉低聚异麦芽糖比较生长曲线。由图2可以看出，橡子粉低聚异麦芽糖对青春双歧杆菌的增殖效果优于葡萄糖对照组。培养的前8 h，橡子粉低聚异麦芽糖组和葡萄糖对照组中，活菌数都没有明显的提高；培养8 h后，两种培养基中双歧杆菌的活菌数都开始有明显的增长趋势，且橡子粉低聚异麦芽糖组培养基中活菌数比葡萄糖组同时间的活菌数高，且都是在36 h后开始进入衰亡期。以橡子粉低聚异麦芽糖为碳源培养的双歧杆菌均比对照组生长速率快，最大生长速率提高（6.59±0.13）%。

2.2 体内润肠通便功能实验

2.2.1 小鼠排便实验

2.2.1.1 各组小鼠灌胃前后体重变化

各组小鼠灌胃前后体重变化结果见表1。

表1 各组小鼠灌胃前后体重变化结果（±s，n=9）Table 1 Weight changes of mice in each group before and after intragastric administration（±s，n=9）g

表1 各组小鼠灌胃前后体重变化结果（±s，n=9）Table 1 Weight changes of mice in each group before and after intragastric administration（±s，n=9）g

注：△表示与0 d相比，差异性显著（p＜0.05）；△△表示与0 d相比，差异性极显著（p＜0.01）。

组别 0 d 10 d 20 d空白对照组 20.26±0.63 22.74±1.48 26.11±1.55△便秘模型组 20.45±0.51 23.02±1.72△ 26.97±0.46△△低剂量组 19.86±1.16 22.32±0.64△ 25.24±0.71△△中剂量组 19.91±1.84 22.43±1.53 26.13±1.37△△高剂量组 20.27±1.57 22.75±0.67 27.00±1.62△

由表1可以看出，空白对照组、高剂量组小鼠灌胃20 d时，体重变化有显著性差异（p＜0.05）；便秘模型组、低剂量组小鼠灌胃10 d时体重有显著性差异（p＜0.05）；而到20 d时，便秘模型组、低剂量组、中剂量组小鼠体重相较于0 d都有极显著性差异（p＜0.01）；且相对于空白对照组其他各组同一时间的小鼠体重并无显著性差异，这说明橡子粉低聚异麦芽糖的灌胃对小鼠体重并无直接影响。

2.2.1.2 各组实验小鼠排首粒黑便时间、8 h内排便粒数和排便质量

各组实验小鼠排首粒黑便时间、8 h内排便粒数和排便质量见表2。

由表2可以看出，各剂量组与空白组组比较均具有极显著性差异（p＜0.01），与便秘模型组相比较均有显著性差异，其中低剂量组排首粒黑便时间表现为显著性差异（p＜0.05），除此之外均变现为极显著性差异（p＜0.01），这说明低、中、高剂量的橡子粉低聚异麦芽糖均能非常明显的增加8 h内排便粒数；与便秘模型组相比，低、中、高剂量组均能非常明显增加便秘小鼠的排便质量；与便秘模型组相比，低、中、高剂量组均能非常明显增加8 h内小鼠的排便粒数；与便秘模型组相比，低剂量组也能明显缩短排首粒黑便时间。并且各检测指标的空白对照组与便秘模型组均为极显著性差异（p＜0.01），表明模型建立成功。

表2 各组实验小鼠排首粒黑便时间、8 h内排便粒数和排便质量Table 2 The first black stool excreted time，the number of feces in 8 h and the mass of defecation of mice in each group（±s，n=9）

表2 各组实验小鼠排首粒黑便时间、8 h内排便粒数和排便质量Table 2 The first black stool excreted time，the number of feces in 8 h and the mass of defecation of mice in each group（±s，n=9）

注：△△表示与空白组相比，差异性极显著（p＜0.01）；*表示与便秘模型组相比，差异性显著（p＜0.05）；**表示与便秘模型组相比，差异性极显著（p＜0.01）。

排便质量/g空白对照组 122.5±10.5** 28.52±1.53** 0.322 8±0.013 4**便秘模型组 193.3±5.2△△ 16.31±1.22△△ 0.204 4±0.012 2△△低剂量组 165.8±13.1△△* 21.83±1.19△△** 0.262 1±0.009 7△△**中剂量组 150.4±10.6△△** 24.45±2.03△△** 0.290 1±0.010 3△△**高剂量组 161.3±12.2△△** 23.11±1.29△△** 0.278 9±0.008 9△△**组别 排首粒黑便时间/min 8 h内排便粒数

同时，从表中数据可以看出，各剂量组实验小鼠排首粒黑便时间均比空白组长，平均延长36.67 min，但比模型组所耗时间平均缩短34.13 min，其中中剂量组效果最为明显；各剂量组8 h内排便粒数虽比空白组略少，但平均比模型组多出6.82粒，其中中剂量组最多；以各剂量组的排便质量来看，略低于空白组，比模型组平均多0.073 g，其中依然是中剂量组效果最为理想。因此，橡子粉低聚异麦芽糖有利于小鼠排便，且中剂量的橡子粉低聚糖效果最好。

2.2.2 小肠推进实验

各实验组小鼠的墨汁推进率见表3。

表3 各实验组小鼠的墨汁推进率（±s，n=9）Table 3 Ink advance rate of mice in each group（±s，n=9）

表3 各实验组小鼠的墨汁推进率（±s，n=9）Table 3 Ink advance rate of mice in each group（±s，n=9）

注：△△表示与空白组相比，差异性极显著（p＜0.01）；*表示与便秘模型组相比，差异性显著（p＜0.05）；**表示与便秘模型组相比，差异性极显著（p＜0.01）。

组别 小肠全长/cm 墨汁推进长度/cm 墨汁推进率/%空白对照组 55.76±5.55 46.09±5.23 82.65±4.98**便秘模型组 62.5±7.29 33.29±6.22 53.26±5.84△△低剂量组 65.03±3.88 38.91±4.19 59.83±5.66△△中剂量组 57.55±7.04 39.30±7.03 68.28±7.02△△**高剂量组 59.73±8.25 37.89±5.29 63.44±3.42△△*

由表3可以看出，便秘模型组与空白对照组小鼠小肠墨汁推进率有极显著性差异（p＜0.01），表明便秘模型建立成功；中、高剂量组与模型组小鼠小肠墨汁推进率，均有显著性差异（p＜0.05），表明中、高剂量的橡子粉低聚异麦芽糖具有促进便秘小鼠小肠墨汁推进率的作用；低、中、高3个剂量组和模型组与空白组小鼠的小肠墨汁推进率均有极显著性差异（p＜0.01），表明低、中、高剂量的橡子粉低聚异麦芽糖均具有促进便秘小鼠小肠墨汁推进率的作用，但效果不明显；低、中、高3个剂量组小鼠的小肠墨汁推进率，两两之间均无显著性差异，但其中中剂量组与模型组差异显著性最为明显（P=0.08），表明中剂量的橡子粉低聚异麦芽糖对促进便秘小鼠小肠墨汁推进率的效果更好。

3 结论

1）以橡子粉低聚异麦芽糖替代葡萄糖为碳源添加到青春双歧杆菌MRS培养基中，发现橡子粉低聚异麦芽糖对青春双歧杆菌具有良好的体外促增殖作用。随着橡子粉低聚异麦芽糖添加浓度的增加，活菌数增加。当橡子粉低聚异麦芽糖替代葡萄糖且浓度为1.5%时，培养24 h后，青春双歧杆菌活菌数为（7.22±0.15）%，达到最大生长量。

以1.5%浓度的橡子粉低聚异麦芽糖为碳源的培养基相较于以葡萄糖为碳源的培养基可促使青春双歧杆菌的生长提前进入稳定生长期，总体看来提高了青春双歧杆菌的生长速率，最大生长速率提高了（6.59±0.13）%。

2）选取 SPF 级雄性小鼠（19 g～21 g）为实验对象，采用复方地芬诺酯建立了小鼠药物便秘模型组，通过灌胃不同浓度的橡子粉低聚异麦芽糖建立低、中、高剂量组，以此研究对便秘小鼠润肠通便的效果。

小鼠排便实验及小肠推进实验的结果表明，低、中、高剂量的橡子粉低聚异麦芽糖均能改善便秘小鼠润肠通便的功能，其中，中剂量的橡子粉低聚异麦芽糖效果较好，说明橡子粉低聚异麦芽糖是很好的润肠通便保健食材，且长期摄入一定量的橡子粉低聚异麦芽糖能达到缓解便秘的效果。

[1] 张志健,王勇.我国橡子资源开发利用现状与对策[J].氨基酸和生物資源,2009,31(3):10-14

[2] 张志健,李新生,陈锐.橡子单宁脱除技术的比较研究[J].食品科技,2008(9):24-27

[3] 李辉,宋居易,刘蕾,等.双歧杆菌RH胞外多糖提取纯化及体外抗凝血活性评价[J].食品科学,2014(23):129-133

[4] 曹伟,赵彩彦,王玮,等.双歧杆菌乳杆菌三联活菌对小鼠急性肝功能衰竭的保护作用及其分子机制[J].中华传染病杂志,2015,33(1):38-43

[5] 孟艳鸽,李岩.不同剂量长双歧杆菌对抗生素诱导大鼠肠道菌群失调的疗效观察[J].中国微生态学杂志,2015,27(3):280-283

[6]白海波.双歧杆菌四联活菌片联合常规用药治疗小儿非感染性腹泻疗效观察及其对血清中IL-6,IL-17表达水平的影响[J].海南医学,2015,26(8):1212-1214

[7] Pinto S S,Verruck S,Vieira C R W,et al.Influence of microencapsulation with sweet whey and prebiotics on the survival ofBifidobacterium-BB-12 under simulated gastrointestinal conditions and heat treatments[J].LWT-Food Science and Technology,2015,64(2):1004-1009

[8] 王敏,帅天罡,秦清娟,等.魔芋葡甘低聚糖对大鼠肠道环境的影响[J].食品科学,2016,37(7):197-203

[9] 王向红,吉爽爽,桑亚新,等.金丝小枣低聚糖的制备及其对双歧杆菌体外促生长的研究[J].中国食品学报,2012,12(9):28-33

[10]郑学玲,张杰,李利民.小麦麸皮戊聚糖的润肠通便效果研究[J].粮食与饲料工业,2008(8):14-16

[11]周慧,易翠平.大米低聚异麦芽糖的润肠通便研究[J].郑州轻工业学院学报:自然科学版,2014,29(6):28-32

[12]曹炎.低成本乳酸菌培养基筛选及其发酵菌液对稻草发酵效果[D].延吉:延边大学,2012

[13]田洪涛,贾英民,马雯,等.嗜热链球菌促生长物质研究及增殖培养基优化筛选[J].食品科学,2002,23(5):60-62

[14]李凤奎.实验动物与动物实验方法学[M].郑州:郑州大学出版社,2007

[15]丁圣,蒋菁莉,刘松玲,等.长双歧杆菌BBMN68对便秘模型小鼠的通便作用[J].食品科学,2011,32(3):195-198

[16]Niittynen L,Kajander K,Korpela R.Galacto-oligosaccharides and bowel function[J].Scandina vian Journal of Food and Nutrition,2007,51(2):62-66

The Analysis Study on Acorn Starch Isomalto-oligosaccharide Functionality

ZHANG Zhi1，LI Qing1，HUA Hong-ling1，YIN Wen-zhe2，LI Jie3，MA Jian-zhang1，*
（1.Northeast Forestry University，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086，Heilongjiang，China；3.Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

The effect of acorn starch isomalto-oligosaccharide on the proliferation ofBifidobacteriumand its laxative effect was explored.Being used as carbon source substitute for glucose in MRS medium，the proliferation test and the comparison of growth curves were done；the constipation model group，blank control group，acorn starch isomalto-oligosaccharide low，medium，and high dose groups were established with mice，at the same time，the experiment of mice defecation and intestinal propulsion were done.Text results showed that the acorn starch isomalto-oligosaccharide had significant promoting effects on the growth ofBifidobacterium adolescentis.With the increase of acorn starch isomalto-oligosaccharide，the viable count of the probiotics increased.When glucose was substituted by the acorn starch isomalto-oligosaccharide with concentration 1.5%，after 24 h culture，the count of theBifidobacterium adolescentiswas（7.22±0.15）%，which had reach to maximum quantity，and acorn starch isomalto-oligosaccharide promoted the growth rates of theBifidobacterium adolescentisand made its stable growth periods earlier.The acorn starch isomalto-oligosaccharide low，medium，and high dose groups all could improve the function of constipation and defecation，in which，the laxative effect of medium dose group was better.The result showed that the acorn starch isomalto-oligosaccharide had good function of promoting the proliferation ofBifidobacteriumand the laxative effect.

acorn starch isomalto-oligosaccharide；Bifidobacterium；growth-promoting effects；laxative

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.006

大熊猫益生菌制剂的研究（SG1409）；黑龙江省应用技术研究与开发计划项目（GA15B203）

张智（1964—），女（汉），教授，博士，研究方向：微生物与发酵工程。

*通信作者：马建章（1937—），男（汉），院士，研究方向：野生动物生态与管理。

2017-03-30