王玉乐，樊欢欢，向国强*，张 衡，宁可可，段俊跃，杨登辉

(1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001; 2.河南工业大学 化学化工学院，河南 郑州 450001)

基于碳量子点修饰纳米硅胶荧光猝灭-恢复测定粮食样品中还原型谷胱甘肽

王玉乐1，樊欢欢2，向国强2*，张 衡2，宁可可2，段俊跃2，杨登辉2

(1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001; 2.河南工业大学 化学化工学院，河南 郑州 450001)

制备了碳量子点修饰硅胶 (SiO2@CDs)，经过Cu2+处理后，根据SiO2@CDs荧光强度恢复程度与还原型谷胱甘肽(GSH)成正比的现象，建立了基于SiO2@CDs荧光猝灭-恢复测定GSH的新方法. 考察了溶液pH值和反应时间对检测体系的影响. 在最佳的实验条件下，GSH浓度在0.2×10-6～8.0×10-6mol/L范围内与SiO2@CDs的荧光恢复程度呈良好线性，检出限(3σ)为0.03×10-6mol/L. 用于粮食样品中GSH的检测，回收率在90.0%～115.2%之间.

碳量子点；荧光法；谷胱甘肽；粮食样品

谷胱甘肽(GSH)乃生物机体内重要的活性物质，且半胱氨酸的侧链集团上有一个非常活泼的巯基，这种结构是谷胱甘肽的许多重要生理功能的基础[1]，例如清除自由基、解毒、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长及细胞的免疫等. 谷胱甘肽分为还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形态. 还原型谷胱甘肽(GSH)是一种特殊的氨基酸衍生物[2]，占谷胱甘肽总含量99.5%. 目前，针对谷胱甘肽等小分子的传统检测方法有比色法[3]、分光光度法[4]、电化学测量[5]、酶催化法[6]以及高效液相色谱法[7]等. 这些分析方法各有优点，但是操作相对复杂，仪器设备昂贵等不足. 荧光传感器因其灵敏度高，检测简便，快速，在诸多分析方法中具有明显优势.

最近，基于QDs荧光猝灭-恢复现象建立的分析方法多见报道[8-11]. 但是大多数工作所用的QDs 都含有有毒重金属元素Cd、Hg、Pb等[12-13]，生物相容性是这种纳米材料临床应用的瓶颈. 碳量子点(Carbon dots, CDs)由于优良的荧光性质和良好生物相容性，在荧光传感分析中受到了广泛关注[14-16]. 相比于传统的荧光有机染料，量子点(QDs)具有宽激发光谱、窄发射光谱、高荧光量子产率和寿命长等优点，是一种理想的分析探针[17-19].

将碳量子点修饰到纳米硅胶表面(SiO2@CDs)，研究表明. Cu2+与CDs表面基团结合，降低SiO2@CDs荧光强度；当体系中加入GSH后，SiO2@CDs荧光强度得到恢复，且恢复程度与GSH浓度相关，从而实现了对GSH的测定. 本方法操作简单，灵敏度高，成本低，可用于粮食样品中GSH的测定.

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

Cary Eclipse荧光光谱仪(Agilent，美国)；透射电镜仪(JEM-2011，日本)；电子天平(BS224S，上海赛多利斯天平公司)；激光散射粒度分析仪(Nano zs-90，英国Malvern公司)；pH计(PHS-3C，上海精密科学仪器公司).

无水柠檬酸(AR 96%，Aladdin)；N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)(AR 96%，Aladdin)；正硅酸四乙酯(TEOS)(AR 96%，国药集团化学试剂有限公司)；还原型谷胱甘肽(GSH)(BR 99%，国药集团化学试剂有限公司)；三氯乙酸(AR 99%，国药集团化学试剂有限公司)；各种金属盐均购于Aladdin公司，均为分析纯(AR)或更高纯度实验用水为二次蒸馏水.

GSH提取剂配制：称取5 g三氯乙酸，186 mg EDTA-Na2·H2O溶解于适量二次蒸馏水中，定容至100 mL备用.

1.2 碳量子点修饰纳米硅胶(SiO2@CDs)的制备

[20]的方法制备碳量子点(CDs)，将无水柠檬酸(0.1 g)加入到有机硅AEAPMS(2 mL)中,加热至230 ℃，反应3 min. 所得反应液用石油醚洗涤三次后溶于适量无水乙醇中. CDs修饰纳米硅胶SiO2@CDs的制备：向25 mL无水乙醇中加入氨水(500 μL)、TEOS(700 μL)室温下搅拌10 min后，加入CDs(70 μL)无水乙醇溶液继续搅拌24 h，产物经离心(4 000 rpm、5 min)后，用无水乙醇洗和蒸馏水洗涤. 所得SiO2@CDs经干燥后，以无水乙醇为溶剂配制成10 g/L悬浮液备用.

图1 碳量子点修饰纳米硅胶的制备Fig.1 Preparation of Carbon Quantum Dot doped Silica gel nanoparticles

1.3 实验方法

1.3.1 SiO2@CDs的荧光猝灭

在10 mL的具塞试管里加入2 mL SiO2@CDs 10 g/L悬浮液和2 mL Cu2+(2 mg/L)溶液，用pH为8的PB缓冲溶液定容，然后在40 ℃水浴锅内加热10 min，流水冷却后备用.

1.3.2 基于荧光猝灭-恢复的GSH测定方法

在10 mL的具塞试管中依次加入1.0 mL用上述Cu2+处理过的SiO2@CDs(SiO2@CDs-Cu2+)悬浮液，一定量的GSH工作液(或样品溶液)，用pH为7.0的PB缓冲溶液定容后，振荡20 s；同时做试剂空白实验；以360 nm作为激发波长，测定实验溶液在荧光发射峰460 nm处的荧光强度F和试剂空白溶液荧光强度F0，计算ΔF=F-F0.

1.4 样品处理

本实验所用粮食谷物样品，均购于超市(郑州，中原区)分别取适量样品置于研钵内研碎，称取出1.0 g粉碎后的样品，加入7 mL GSH提取剂，振荡，离心(12 000 rpm、10 min、4 ℃)，收集上清液待测.

2 结果与讨论

2.1 碳量子点修饰纳米硅胶(SiO2@CDs)的表征

以柠檬酸为碳源制备的荧光碳点(表面含-OH和-COOH)与有机硅试剂(AEAPMS)(含有-NH2)通过形成酰胺键(-COOH与-NH2之间的反应)实现碳点与有机硅的连接. 从FT-IR光谱图可以看出，CDs和CDs修饰纳米硅胶在1 654 cm-1(C=O) 处都有C=ONR伸缩振动和3 456 cm-1处N-H振动，而纳米硅胶没有这一特征峰. 每一步的反应产物在800 cm-1和1 100 cm-1处都有Si-O伸缩振动和Si-CH2-伸缩振动峰. 上述特征峰表明成功的合成了CDs修饰纳米硅胶. TEM测试表明SiO2@CDs的平均粒径为200 nm.激光散射粒度分析实验结果显示SiO2@CDs的平均粒径为201 nm，与TEM结果相吻合. (图2)

图2 CDs修饰纳米硅胶的表征(TEM(上)，FT-IR(中，其中a表示CDs；b表示CDs 修饰硅胶纳米粒子；c表示硅胶纳米粒子)，激光粒度散射分布(下))Fig.2 Characterization of CDs doped silica gel nanoparticles(TEM (top), FT-IR spectrum (middle): (a) CDs; (b) CDs doped silica gel nanoparticles; (c) silica gel nanoparticles; laser scat-tering particle size chart (down))

2.2 Cu2+对SiO2@CDs的荧光猝灭

根据文献[21]报道，AEAPMS修饰CDs由于AEAPMS中乙二胺分子结构与Cu2+具有较强的结合能力而使得Cu2+是CDs的良好猝灭剂，且具有较好的选择性. 由图3明显看出，随着Cu2+浓度增大，SiO2@CDs的荧光强度逐渐降低(彩色线). 因此，本实验方法选取Cu2+作为SiO2@CDs的荧光猝灭剂.

2.3 GSH对猝灭的SiO2@CDs荧光的恢复

考察了GSH对SiO2@CDs-Cu2+体系的荧光恢复情况，如图4所示. 随着GSH浓度的增大，SiO2@CDs-Cu2+体系的荧光逐渐增大，表明SiO2@CDs的荧光逐渐恢复. 由于Cu2+对SiO2@CDs的荧光猝灭作用是Cu2+与CDs表面基团结合引起，而GSH中的-SH集团具有更强的与Cu2+结合能力，GSH的加入使得CDs表面结合的Cu2+部分被解析下来与GSH结合，这使得SiO2@CDs荧光得以恢复.

2.4 测定条件优化

2.4.1 pH的影响

图5是pH对GSH测定的影响，可以看出，SiO2@CDs-Cu2+与SiO2@CDs-Cu2+-GSH体系的荧光信号随着pH值变化表现出相似规律，都是随着pH增大(5～7),荧光信号逐渐增强；而当pH进一步增大时(7～9)时，荧光信号开始明显降低. 而ΔF值在PH 7时达到最大值. 因此，选定pH 7作为体系pH条件.

2.4.2 反应时间的影响

根据传感机理，加入GSH将置换与AEAPMS结合的Cu2+,因此反应时间也是影响荧光恢复的重要因素. 考察了反应时间对荧光恢复量(ΔF)的影响，结果表明，加入GSH后反应20 s，反应体系的荧光恢复量(ΔF)达到最大，并在一定时间保持不变. 因此，选取20 s作为最佳反应时间.

2.5 共存物质的干扰

在优化的实验条件下，共存物质对GSH测定的影响. 当相对误差±10%时，体系中GSH浓度为2.5×10-6mol/L时，共存物质的干扰允许浓度如表1 所示. 由表1可知，多数氨基酸有较大的干扰允许量，而半胱氨酸因为也含有-SH基团，其干扰允许浓度为2.0×10-6mol/L. 大多数金属离子对GSH测定没有干扰.

SiO2@ CDs 1.0 g/L, Cu2+ 0～500 μg/L, pH 8.0.图3 Cu2+对CDs修饰硅胶纳米粒子的荧光猝灭作用Fig.3 Fluorescence quenching effect of Cu2+ on the CDs doped silica gel nanoparticles

SiO2@CDs (1.0 g/L), GSH (0.2×10-6～8.0×10-6 mol/L), PB buffer solution at pH 7, vibration 20 s.图4 GSH对SiO2@CDs-Cu2+体系的荧光恢复作用Fig.4 Fluorescence recovery of GSH to SiO2@CDs-Cu2+ system

SiO2@CDs (1.0 g/L), GSH (2.5 ×10-6 mol/L), PB buffer solution at different pH, vibration 20 s.图5 pH对荧光猝灭-恢复体系的影响Fig.5 Effects of pH on the fluorescence quenching-recovery system

表1 常见干扰物质的最大允许浓度Table 1 Tolerance amounts of foreign substances

2.6 分析性能

在优化条件下，分析方法对GSH的检出线(3σ)为0.03×10-6mol/L，线性范围位0.2×10-6mol/L～8.0 ×10-6mol/L(ΔF=51C+19.6)，相对标准偏差(RSD)为4.9%(C=2.5×10-6mol/L)

表2 样品中GSH含量的测定(n=3, mean ±SD, μg/g)Table 2 Analytical results of GSH in grain samples (μg/g, n=3)

3 实际样品分析

将本方法应用于稻米，绿豆和小麦样品中GSH的测定. 采用标准曲线法对提取液中GSH含量进行了测定，并做了加入回收实验，回收率在90%～115.2%之间.

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Determinationofreducedglutathioneingrainsamplesbasedonfluorescencequenching-recoveryofcarbondotsdopedsilicagelnanoparticles

WANG Yule1, FAN Huanhuan2, XIANG Guoqiang, ZHANG Heng2, NING Keke2, DUAN Junyue2, YANG Denghui2

(1.SchoolofFoodScienceandTechnology,HenanUniversityofTechnology.Zhengzhou450001,Henan,China;2.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou450001，Henan，China)

Carbon dots doped silica gel nanoparticles (SiO2@CDs) were prepared. The fluorescence intensity of the SiO2@CDs was significantly quenched in the presence of Cu2+with adding reduced glutathione(GSH), and the fluorescence of SiO2@CDs was recovered after Cu2+reacted with GSH. The degree of recovery of the SiO2@CDs fluorescence intensity was proportional to the GSH concentration. Based on the results, a new analytical method for GSH was developed. Under the optimized experiment conditions, the detection limit (3σ) of the method was 0.03×10-6mol/L with a linear rang of 0.2×10-6-8.0×10-6mol/L. The method has been successfully applied for the detection of GSH in grain samples with the recoveries of 90.0%-115.2%.

carbon dots; fluorescence method; glutathione (GSH); grain samples

O657.3

A

1008-1011(2017)05-0633-06

2017-05-21.

河南省教育厅高校科技创新人才项目(13HASTIT016).

王玉乐(1992-)，女，研究方向:食品分析技术.*

, E-mail:xianggq@126.com.

[责任编辑：张普玉]