吴思婧　熊安琪　易子琳

摘要：采用组织培养法和枝条扦插法对缙云黄芩（Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow）进行诱导和繁殖。组织培养通过对缙云黄芩外植体进行消毒，获得无菌苗后将其茎段及叶片分别接种于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA、1.0 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L KT的2种MS培养基中进行不定芽诱导，60 d后统计诱导情况；采用20、50、80 mg/L IAA和NAA 6种植物生长调节剂处理缙云黄芩枝条切口进行扦插繁殖，30 d后统计生根情况，将繁殖的幼苗进行野外移栽试验。结果表明，缙云黄芩可通过组织培养和扦插进行繁殖，其茎段是直接诱导出芽的良好外植体，2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L的IAA诱导不定芽，可达75%的出芽率；50、80 mg/L IAA处理的缙云黄芩扦插苗成活率明显高于其他处理；原生境野外回归可以实现其抢救性保护。

关键词：缙云黄芩（Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow）；扦插繁殖；组织培养

中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）19-3723-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.032

Abstract： The tissue culture method and shoot cutting method were used to induce and propagate Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow. The tissue culture was carried out by disinfecting the explants of Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow. The stem and leaves were inoculated into different MS mediums（added 2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA or 1.0 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L KT）and induced adventitious buds. Then we statistics the rate of induction after 60 days. The cutting propagation of Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chows branches was treated with different concentration of IAA and NAA （20，50，80 mg/L） and the rooting rate after 30 days was counted. The seedlings will be transplanted to the wild. The results showed that Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow could be propagated through tissue culture and cutting， and the stem segments can directly induce budding. The germination rate reached 75% under the induction of 2.0 mg/L 6-BA and 0.2 mg/L IAA. The survival rate of the cuttings of Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow was significantly higher than that of other treatments at 50， 80 mg/L IAA. Field regression can achieve its rescue protection.

Key words： Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow；cutting propagation；tissue culture

缙云黄芩（Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow），唇形科黄芩属多年生草本植物，其根茎可入药。现代药理研究表明，黄芩属植物的提取物和单体化合物具有抗肿瘤、保肝、抗氧化、抗炎、抗惊厥、抗菌、抗病毒等作用[1]。缙云黄芩是重庆市缙云山特有的分布种[2]，主要生长于海拔330～820 m的林下或林间空隙，尤喜水沟边或路旁林沿等阴湿但又有一定光照的环境，居群面积小且呈相互隔离的屿状分布，现存个体数量较少。该物种于1966年被首次发现，由于在形态上接近同属的云南黄芩，当时仅将其作为云南黄芩的一个新变种——云南黄芩短柄变种，后于1977年作为新种收录入中国植物志第65卷第2分册，定名为缙云黄芩[3]。

林长松等[4]研究表明，缙云黄芩种群数量及个体数量呈减少趋势，分布范围和个体数量不断减少，已经处于濒危状态。李俊敏等[5]从缙云黄芩与其他濒危植物的生态位研究发现，缙云黄芩主要面临的是在一定的生境中与其伴生物种对资源利用的相似性程度较高、生境及种群遭人为破坏严重的问题，这也是导致其濒危的重要因素。由于缙云黄芩小坚果萌發率低，其有性生殖能力亦较低。因此，对缙云黄芩的保护迫在眉睫，应尽快采用人工栽培帮助其复壮和扩大居群。本研究通过对缙云黄芩快速繁殖的探究，初步建立缙云黄芩组织培养和扦插培育体系，以期为缙云黄芩的抢救性保护提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

缙云黄芩取自重庆市缙云山洛阳桥（N 29°50′，E 106°23′，海拔高度726 m），选取健康、长势一致的枝条。

6-苄氨基嘌呤（6-BA）、吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-糠氨基嘌呤（KT）、萘乙酸（NAA）均为成都市科龙化工试剂厂产品。腐殖土、珍珠岩、蛭石等购自重庆北碚花鸟市场。

1.2 试验方法

1.2.1 缙云黄芩组织培养

1）外植体的消毒：将缙云黄芩枝条去除叶片，保留腋芽和顶芽，用自来水加适量洗衣粉清洗，再用自来水洗净，后流水冲洗1 h，75%乙醇浸泡30 s，后用无菌水冲洗，再用0.1%升汞消毒6 min，最后用無菌水冲洗。

2）无菌苗的获得：将处理好的枝条剪成1.0～1.5 cm的带顶芽或腋芽的茎段，接入pH 5.8的MS培养基（其中添加蔗糖30 g/L，琼脂6.2 g/L）。每瓶植入2～3 个外植体，共10瓶，在光照度5 000 lx，光照时间14 h/d，温度25 ℃光照培养箱中培养18 d，统计污染和存活情况，获得无菌苗，用于不定芽的诱导。

3）不定芽的诱导：将无菌苗茎段和叶片在无菌操作台上切成0.5～1.0 cm长度茎段和0.5～1.0 cm2的叶片，接种于2种不同植物生长调节剂配方的MS培养基（2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA和1.0 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L KT）中，在光照度5 000 lx，光照时间14 h/d，温度25 ℃培养箱中培养60 d后，统计生长状况。

1.2.2 缙云黄芩的扦插

1）插穗的采集和处理。阴天早上8：00～10：00采集插穗，采穗前用喷壶给叶面洒水，防止穗条失水。用修枝剪把穗条截成长10 cm左右，每根插条保留最顶端两叶和一芽，除去基部叶片，切口为直角，平滑无破裂。

2）植物生长调节剂种类及浓度对缙云黄芩生根的影响。试验以IAA和NAA为外源植物生长调节剂，分别设置低浓度（20 mg/L）、中等浓度（50 mg/L）和高浓度（80 mg/L）6个试验组，以清水为对照，将缙云黄芩切口部位在植物生长调节剂溶液中浸泡 2 h后进行扦插。扦插基质为腐殖土∶蛭石∶珍珠岩= 3∶1∶1，扦插深度3 cm，插穗间距10 cm。在25 ℃、光照度3 000 lx、光照时间14 h/d的温室中培养，每天浇水并观察生长情况，30 d后统计成活率。

2 结果与分析

2.1 缙云黄芩的组织培养

2.1.1 无菌苗的获得 缙云黄芩的生长环境大多阴暗潮湿，采集的枝条附带大量微生物，难以彻底消毒。获得无菌材料时，外植体消毒时既要杀死枝条表面的全部微生物，使污染率降到最低，又要保持外植体的活力。本试验采用的二次消毒法，培养18 d后统计污染与生长状况。污染率降低到66.7%，存活率达到33.3%。

MS培养基营养元素全面，能够提供组织生长所需的矿质营养[6]。培养40 d后，结果表明，缙云黄芩无菌苗能够在MS培养基上较好地生长，茎较粗壮、直立，顶部少量褐化，新叶呈健康绿色，叶片伸展，少数无菌苗长出须根（图1）。

2.1.2 不定芽诱导 缙云黄芩无菌苗培养40 d后，用茎段和叶片为外植体诱导不定芽，60 d后的统计结果见表1和图2。缙云黄芩茎段在不同植物生长调节剂配方的MS培养基中的出芽率差异明显，以2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA诱导时，茎段出芽率达到75.0%，褐化率仅为25.0%；以1.0 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L KT诱导时未长出不定芽，外植体全部褐化。2种配方处理下叶片均不能直接诱导出不定芽，而是先形成愈伤组织，但愈伤组织100.0%褐化。以上结果表明，缙云黄芩茎段是直接诱导出芽的良好外植体，其在添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA的MS培养基中能够较好地产生不定芽。

2.2 缙云黄芩的扦插繁殖

2.2.1 不同植物生长调节剂种类及浓度对缙云黄芩扦插生根的影响 不同植物生长调节剂种类及浓度对缙云黄芩扦插生根的影响结果见表2和图3。与对照组相比，所有添加植物生长调节剂的处理均不同程度地提高了缙云黄芩插条的生根率。在相同浓度下，IAA处理的插条生根率均高于NAA处理。说明IAA更适合用于缙云黄芩的扦插生根。对于不同浓度的IAA处理，50、80 mg/L的IAA刺激下缙云黄芩插条生根率均较高，为75.0%。但从节约资源的角度考虑，50 mg/L的IAA浓度是提高缙云黄芩扦插生根率的较优选择。

2.3 缙云黄芩扦插苗的野外回归

将缙云黄芩扦插苗移栽至发现地（原生境）。通过移栽后的7、30 d，一季度等时间段的观察，认为扦插苗已经适应了野外环境，扦插苗野外回归存活率100.0%（图4）。在后续研究中需要进一步跟踪其品质变化，确认其抢救性保护可以通过组织培养和扦插进行快速繁殖、原生境野外回归来实现。

3 结论

1）研究表明，缙云黄芩可以通过组织培养和扦插进行快速繁殖，原生境野外回归的成功证实可实现其抢救性保护。

2）缙云黄芩以叶片进行组织培养未诱导出不定芽，而缙云黄芩茎段是直接诱导出芽的良好外植体，其出芽率可达75.0%以上，褐化率较低（25.0%以下）。

3）IAA适用于缙云黄芩的扦插。50、80 mg/L的IAA刺激下插条生根率均可达到75.0%。

参考文献：

[1] 厍士芳.黄芩属植物的药用价值研究[J].中医药信息，2012， 29（3）：139.

[2] 张家辉，杨 蕊，邓洪平.缙云黄芩HPLC指纹图谱的建立及其不同部位活性成分含量研究[J].中国中药杂志，2009，34（19）：2485-2487.

[3] 杨 牟.缙云山黄芩属（Scutellaria Linn.）植物的细胞学与叶表皮微型态分析[D].重庆：西南大学，2015.

[4] 林长松，何 平，邓洪平.缙云山特有植物缙云黄芩的遗传多样性研究[J].西北植物学报，2003，23（4）：566-571.

[5] 李俊敏，何 平，林永慧，等.缙云山特有植物缙云黄芩种群生态位研究[J].西南师范大学学报（自然科学版），2004，29（3）： 451-455.

[6] 杨秀平，刘莉丽.植物组织培养常用基本培养基的数量分析[J].西北林学院学报，2010，25（1）：97-100.