田新民　石兰英

摘要：为了评价黑龙江林蛙（Rana amurensis）胃肠道消化酶的活力，为其科学人工养殖提供参考，分别采用福林-酚试剂法、聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法和3，5-二硝基水杨酸比色法对黑龙江林蛙的胃和肠道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力进行了分析。结果表明，pH和温度与3种消化酶的关系曲线均呈单峰型；蛋白酶的活力胃部高于肠道，胃蛋白酶和肠蛋白酶的最适pH分别为1.5和7.2，最适温度均为50 ℃；脂肪酶的活力肠道高于胃部，胃脂肪酶和肠脂肪酶的最适pH分别为3.2和6.2，最适温度均为40 ℃；淀粉酶的活力肠道高于胃部，胃淀粉酶和肠淀粉酶的最适pH均为7.2，最适温度均为40 ℃。基于上述数据，建议配制黑龙江林蛙饲料时，将蛋白质成分分布在饲料颗粒外围，脂类和淀粉成分在饲料颗粒中心，有助于提高饲料的消化率。环境温度较高时，饲料中可适当提高蛋白质成分，减少脂类和淀粉成分的配比。

关键词：黑龙江林蛙（Rana amurensis）；消化道；消化酶；活力

中图分类号：Q55 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）19-3703-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.025

Abstract： In order to provide a reference for Rana amurensis scientific breeding，the activity of protease，lipase and amylase in the stomach and intestinal tract of Rana amurensis were analyzed by Folin phenol reagent method，polyvinyl alcohol olive oil emulsion hydrolysis method and 3，5-two nitro salicylic acid colorimetric method. The results showed that the relationship curves of three digestive enzymes with pH value and temperature all showed single peak pattern，respectively. The activity of protease in stomach was higher than in intestine，the optimum pH value of pepsin and proteinase was 1.5 and 7.2，respectively，and the optimum temperature was 50 ℃. The lipase activity in the intestine was higher than in the stomach，and the optimum pH values was 3.2 and 6.2，respectively，and the optimum temperature was 40 ℃. The activity of amylase in the intestine was higher than that in stomach，and the optimum pH value was 7.2，the optimum temperature was 40 ℃. Based on the above data，it suggested that the protein components would be distributed around the feed particles，and the lipid and starch components in the center of the feed particles，which could improve the digestibility of the feed. When the environmental temperature is high，the protein composition could be increased appropriately， and the ratio of lipid and starch components should be reduced.

Key words： Rana amurensis； gastrointestinal tract； digestive enzymes； activity

黑龍江林蛙（Rana amurensis）隶属于蛙科林蛙属，国内主要分布于东北三省和内蒙古地区，具有较高的经济价值和药用价值[1，2]。环境的破坏和人类的滥捕，使该种群数量急剧减少，黑龙江林蛙的人工养殖得到重视。消化道内消化酶活力的研究可为了解林蛙对食物不同成分的消化能力、饲料的选择以及人工饲养条件的确立提供重要参考资料[3]。关于低等脊椎动物消化酶的研究主要集中在鱼类[4-6]和爬行类[7，8]，两栖类[9，10]相对较少，而对黑龙江林蛙的相关研究还未见报道。因此，本研究对黑龙江林蛙胃肠道3种消化酶的活力进行了分析，可为其人工养殖提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来自黑龙江省密山市，为鲜活成年个体，体重15～30 g，带回实验室立即进行试验分析。双毁髓处死，剖腹，取出消化道，剪开后用4 ℃、 0.65%的生理盐水快速洗净。剪出胃和肠道，用滤纸吸干表面生理盐水，称重备用[3]。

1.2 材料处理

根据所得组织质量加入20倍蒸馏水，冰浴中高速分散均质机匀浆。4 ℃、4 000 r/min离心20 min，取上清液即为粗酶提取液，保存于4 ℃冰箱内，8 h内分析完毕[11]。

1.3 试验方法

蛋白酶的活力测定采用福林-酚试剂法[12]，脂肪酶的活力测定采用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法[13]，淀粉酶活力测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法[12]。以KCl-HCl配制pH 0.5～1.5的缓冲液，Na2HPO4-柠檬酸配制pH 5.2～8.0的缓冲液，巴比妥钠-HCl配制pH 8.0～9.2的缓冲液[12]。

胃蛋白酶采用pH 0.5、1.0、1.5、2.2、2.6五个梯度，肠蛋白酶采用pH 5.2、6.2、7.2、8.0、9.2五个梯度；胃脂肪酶采用pH 1.0、1.5、2.2、3.2、4.2、5.2、6.2七个梯度，肠脂肪酶采用pH 3.2、4.2、5.2、6.2、7.2、8.0、8.8七个梯度；胃淀粉酶和肠淀粉酶均采用pH 5.2、6.2、7.2、8.0、8.8五个梯度。所有酶均在30 ℃条件下确定最适pH，在所得的最适pH条件下确定最适温度。温度由恒温水浴锅控制，采用20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃梯度，其中蛋白酶采用30～65 ℃八个梯度，脂肪酶和淀粉酶采用20～65 ℃十个梯度。

由于每一类酶的试验体系相同，为简化试验过程，故采用吸光度代表蛋白酶和淀粉酶的活力，NaOH滴定的毫升数代表脂肪酶的活力，进行数据分析。标准差的计算和数据作图采用Excel 2003完成。

2 结果与分析

由图1～图6可见，pH和温度与3种消化酶的关系曲线均呈单峰型，即每种酶在30 ℃条件下均存在最适pH，在最适pH条件下均存在最适温度。胃蛋白酶和肠蛋白酶的最适pH分别为1.5和7.2，最适温度均为50 ℃。胃蛋白酶活力在各自的pH范围内和温度范围内均高于肠蛋白酶，胃蛋白酶和肠蛋白酶在最适pH和最适温度两侧均呈下降趋势。

胃脂肪酶和肠脂肪酶的最适pH分别为3.2和6.2，最适温度均为40 ℃。在最适pH条件下20～65 ℃范围内，肠脂肪酶活力均高于胃脂肪酶。

胃淀粉酶和肠淀粉酶的最适pH均为7.2，最适温度均为40 ℃。淀粉酶的活力肠道高于胃部，在最适温度两侧两种淀粉酶的活力下降趋势剧烈，高于55 ℃后淀粉酶基本失活。

3 小结与讨论

黑龙江林蛙消化道的胃部和肠道均具有蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力。蛙类通常为肉食性动物，黑龙江林蛙消化道内的淀粉酶活力检测结果提示在黑龙江林蛙饲料配制时可适当添加淀粉成分。蛋白酶活力胃高于肠道，淀粉酶和脂肪酶活力肠道高于胃，说明黑龙江林蛙对蛋白质的消化主要在胃部，淀粉和脂类物质的消化主要在肠道。本试验中蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的研究结果与黑斑蛙[3，11，14]、牛蛙[15]和虎纹蛙[10]相一致。根据黑龙江林蛙消化酶的活力分布特点，在配制黑龙江林蛙人工饲料时，建议将蛋白质成分分布在饲料颗粒的外围，脂类和淀粉成分分布在饲料颗粒的中心，将有助于提高其对饲料的消化率。

酶的活力受pH影响显著，各种酶只有在一定的pH范围内才能表现出活力，并存在最适pH[15]。本研究中胃蛋白酶和肠蛋白酶的最适pH分别为1.5和7.2，与黑斑蛙和虎纹蛙的胃和肠蛋白酶最适pH分别为1.5和7.4基本一致[11，16]。黑龙江林蛙胃脂肪酶和肠脂肪酶的最适pH分别为3.2和6.2，其胃脂肪酶最适pH高于牛蛙胃脂肪酶最适pH（2.2）[15]，低于黑斑蛙与虎纹蛙（最适pH分别为5.0和9.0）[3，10]；但黑龙江林蛙肠脂肪酶的最适pH均低于牛蛙、黑斑蛙和虎纹蛙（分别为7.4、7.5和9.0）[3，10，15]。黑龙江林蛙胃淀粉酶和肠淀粉酶的最适pH均为7.2，与牛蛙的7.0和8.0[15]，黑斑蛙的7.4和8.0[14]，虎纹蛙的8.6和7.0[10]基本一致。说明这些蛙类的淀粉性食物主要在肠道消化，胃部不利于淀粉的消化，这与上述酶活力分布的结果相一致。

黑龙江林蛙胃蛋白酶和肠蛋白酶的最适温度均为50 ℃，胃脂肪酶和肠脂肪酶最适温度均为40 ℃，胃淀粉酶和肠淀粉酶的最适温度也均为40 ℃，与牛蛙、黑斑蛙和虎纹蛙的研究结果基本一致[3，10，11，14，15]，均高于适宜的栖息环境温度。同时表明，黑龙江林蛙消化道脂肪酶和淀粉酶的抗热性要比蛋白酶差，基于此特点，在黑龙江林蛙人工养殖中，环境温度升高时可在饲料中适当提高蛋白质成分，减少脂类和淀粉成分的配比。黑龙江林蛙属变温动物，多数蛙类其适宜的生存温度范围为5～35 ℃[14，15]，黑龙江林蛙脂肪酶和淀粉酶的最适温度与其栖息环境温度的上限相当，蛋白酶远高于栖息的环境温度，这与其他蛙类研究结果吻合[3，10，11，14，15]。最适温度受反应条件影响，如作用时间延长最适温度下降，蛙消化食物时酶促反应时间较长，这可以解释最适温度高于生理温度的现象[11，17]。

参考文献：

[1] 谢 锋，叶昌媛，费 梁，等.中国东北地区林蛙属物种的分类学研究[J].动物分类学报，1999，24（2）：224-231.

[2] 李殿伟，赵文阁，刘 鹏，等.黑龙江省东部两种林蛙两性异形比较研究[J].黑龙江畜牧兽医，2015（7）：222-224.

[3] 张盛周，朱联九，钱 玉，等.pH和温度对黑斑蛙消化道脂肪酶活力的影响[J].安徽师范大学学报，2008，31（2）：159-162.

[4] 叶继丹，卢彤岩，刘洪柏，等.六种鲟鱼消化酶活性的比较研究[J].水生生物学报，2003，27（6）：590-595.

[5] 梅景良，马燕梅，王 宏，等.pH值对黑鲷胃肠道及肝胰脏主要消化酶活力的影响[J].云南农业大学学报，2004，19（5）：592-595.

[6] 白东清，梁广海，苗建发，等.温度和pH值对卡拉白鱼消化组织淀粉酶活性的影响[J].天津农学院学报，2012，19（3）：40-43.

[7] 白东清，龙良启，汤保贵，等.中华鳖消化组织脂肪酶的初步研究[J].水利渔业，1996（4）：14-15.

[8] 王小龙，侯天德，张建萍，等.温度对虎斑颈槽蛇消化酶活性的影响[J].四川动物，2008，27（6）：1058-1061.

[9] TEO L H，CHEN T W，TAN L L. The proteases of the common Malayan toad Bufo melanostictus Schneider[J].Comp Biochem Physiol，1990，96B（4）：715-720.

[10] 李 庆，张 雪，余昌平，等.虎纹蛙消化道淀粉酶和脂肪酶活力研究[J].激光生物学报，2014，23（2）：159-164.

[11] 张盛周，朱升学，刘 明，等.黑斑蛙消化系统蛋白酶的活力[J].動物学杂志，2004，39（1）：25-28.

[12] 北京师范大学生物系生物化学教研室.基础生物化学实验[M].北京：高等教育出版社，1982.

[13] 杨安刚，毛积芳，药立波.生物化学与分子生物学实验技术[M].北京：高等教育出版社，2001.

[14] 张盛周，朱联九，朱升学，等.黑斑蛙消化道淀粉酶的活力[J].安徽师范大学学报，2009，32（2）：153-156.

[15] 朱联九，朱升学，程文娟，等.牛蛙主要消化酶的分布及pH和温度对消化酶活力的影响[J].激光生物学报，2008，17（4）：496-501.

[16] 张盛周，朱升学，佟 媛，等.pH值和温度对虎纹蛙消化系统蛋白酶活力的影响[J].安徽师范大学学报，2005，28（2）：200-202.

[17] 杨蕙萍，童圣英，王子臣.国内外关于水产动物消化酶研究的概况[J].大连水产学院学报，1998，13（3）：64-71.