胡畔，王加璐，何志义

（中国医科大学附属第一医院神经内科，沈阳 110001）

北方汉族缺血性脑卒中人群ABCB1基因rs1045642多态性与氯吡格雷抵抗的相关性研究

胡畔，王加璐，何志义

（中国医科大学附属第一医院神经内科，沈阳 110001）

目的探讨中国北方汉族缺血性脑卒中人群ABCB1基因rs1045642多态性与氯吡格雷抵抗（CR）之间可能存在的关系。方法选取110例急性缺血性脑卒中患者，入院后口服氯吡格雷（75 mg/d），于首日给药前及服用药物7 d时分别采集静脉血（2 mL），测定血小板聚集率。CR定义为2次血小板聚集率的变化值不超过10%。所有患者根据结果被分为CR组和非CR（NCR）组。提取基因组DNA后用PCR扩增目的基因并用RFLP法测定SNP。结果ABCB1基因rs1045642位点TT基因型频率CR组与NCR组比较明显升高（P = 0.003）。相比于携带C等位基因，携带T等位基因频率在CR组明显高于 NCR 组（P = 0.001）。结论北方汉族缺血性脑卒中患者中，ABCB1基因在SNP位点rs1045642的多态性可能是CR发生的一个独立危险因素，T等位基因可能是CR发生的风险基因。

缺血性脑卒中； ABCB1基因； 单核苷酸多态性； rs1045642； 氯吡格雷抵抗

网络出版时间：

脑卒中是严重危害人类健康的一种疾病，其发病率、复发率、致残率及死亡率均高，其中有60%～80%患者为缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）［1］。美国心脏学会和美国卒中学会的脑卒中治疗指南指出，在IS或短暂脑缺血发作（transient ischemic attack，TIA）患者的治疗中，氯吡格雷是重要的抗血小板聚集药物［2］。作为一种不具备活性的前体药物，其抗血小板作用并非直接产生，而是需要通过体内的吸收及代谢转变为具有活性的成分，进而对血小板的聚集产生抑制作用［3］。部分患者在长期服用氯吡格雷情况下仍有缺血事件发生，该现象被称为氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）［4-5］。药物代谢动力学及药效学研究［6］表明，氯吡格雷在体内吸收、代谢、药理活性均可能受到基因多态性的调节，基因多态性与CR之间的关系受到越来越多学者们的关注［7］。目前对CR的检测方法没有统一标准，最常用的方法是对血小板聚集率的测量［8］。

ABCB1基因变异可能会引起个体间药物吸收代谢差异，影响或干扰氯吡格雷药物的吸收，从而参与CR的发生［9］。目前国内外针对与氯吡格雷吸收相关的ABCB1基因多态性在IS患者中研究很少。中国是IS的高发国家，对ABCB1基因多态性与CR间关系的研究能够为抗血小板药物的个体化治疗提供新的依据，对于降低IS事件发生率具有重要意义及临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

试剂包括ADP诱导剂（美国HELENA公司）、全血基因组DNA小量纯化试剂盒（WLA057b，沈阳Wanleibio 公司）、Goldview I （G8140，北京 Solarbio公司）、Powder琼脂糖（11860，Spain）、50×TAE（N10053，北京海利克思公司）、2×Power Taq PCR MasterMix（PR1702，北京BioTeke公司）、引物（上海生工生物工程公司）。仪器包括血小板聚集仪（Aggram）、离心机（LD5-2A）、超纯水系统（NW10LVF）、超速冷冻离心机（H-2050R）、微量移液器（Proline）、PCR仪（Life Express）、电泳仪（DYY-7C）、紫外分光光度计（NANO 2000）、凝胶成像分析仪（WD-9413B）。

1.2 研究对象及方法

1.2.1 研究对象：选取2015年3月至2016年10月期间中国医科大学附属第一医院神经内科收治的IS患者110例。研究经过中国医科大学伦理委员会批准，所有参与本项研究的患者均已告知具体情况并签署知情同意书。入选标准：年龄≥18岁；NIHSS评分＜26分；急性动脉粥样硬化性脑梗死和TIA患者。排除标准：心源性或其他不明原因导致的脑梗死；患有血液系统或出血性疾病；血小板计数＞450×109/L或＜100×109/L；近1月内使用对血小板聚集功能有影响的相关药物；近1个月内进行较大外科手术；氯吡格雷过敏或其他原因导致不能服用；患有癌症、自身免疫性疾病或其他严重脏器疾病；年龄＜18岁；非汉族。

1.2.2 研究方法：收集研究对象的临床资料，包括身高、体质量、血压、年龄、性别、是否吸烟、曾用药物等。实验室检测包括血尿常规、凝血功能、肝肾功能、空腹血糖、血清甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高/低密度脂蛋白胆固醇（high / low density lipoprotein cholesterol，HDL-C/LDL-C）等。入院后清晨空腹采集外周静脉血（5 mL），EDTA抗凝，以用于基因组DNA的提取，并分析ABCB1 rs1045642位点的基因型。研究对象口服氯吡格雷治疗，药物剂量为75 mg/d，于首日给药前及给药7 d时采集静脉血（2 mL），3.2%枸橼酸钠抗凝，通过光比浊法测定血小板聚集率（maximal platelet aggregation rate，MPAR），收集的血样在室温条件下2 h内进行检测。将5 μ mol/L二磷酸腺苷 （adenosine diphosphate，ADP）诱导下的MPAR在服用氯吡格雷前和服用7 d后的差值≤10%定义为CR［4］。并由此将入选患者划分为CR组和非CR（NCR）组。

1.3 基因型检测

按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书提取外周血基因组DNA，通过HapMap数据库对中国北京汉族人群（Chinese Han in Beijing，CHB）样本进行查询，选择本研究的标签SNP为rs1045642。从NCBI官网公布的dbSNP库查询rs1045642的位点序列，之后通过在线网站WatCut进行内切酶查询，并选定DpnI作为后续实验选用的内切酶。根据NCBI网站的Genebank数据库公布的ABCB1序列信息，利用primer premier 5.0软件进行引物设计。具体如下：F，5’-TGAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3’；R，5’-TACCCCTAAGGCTGACAAAGG-3’。引 物 设 计完成后由生工生物工程技术有限公司（上海）进行引物合成。利用NCBI的BLAST核酸数据库验证，产物片段509 bp。PCR反应体系20 μ L，其中DNA模板1 μ L，上下游引物各1 μ L，2×Taq PCR Master-mix 10 μ L，ddH2O 7 μ L。PCR反应条件为：95 ℃ 预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，35个循环后，25 ℃延伸2 min。酶切反应体系20 μ L：ddH2O 7 μ L，10×Buffer 2 μ L，PCR产物10 μ L，内切酶1 μ L。酶切反应后利用3 %的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测。

1.4 统计学分析

将患者的一般临床资料及实验室检查结果建立EXCEL数据库，根据PCR-RFLP实验结果整理rs1045642位点SNP分型信息，利用SPSS19.0统计分析软件进行相关的统计分析。采用χ2拟合优度检验进行Hardy-Weinberg （H-W）平衡分析。计量资料用x-±s表示，比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验。组间基因型及等位基因频率比较采用四格表χ2检验。P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者临床资料比较

在5 μ mol/L ADP诱导下，MPAR在服用氯吡格雷前和服用氯吡格雷7 d后变化值≤10%共计35例。110例患者中有31.8%归于CR组（35例），68.2%归于NCR组（75例）。2组患者年龄、性别、既往卒中史等比较均无统计学差异（P ＞ 0.05）。常规实验室检查结果也未见统计学差异（P ＞ 0.05）。见表1。

2.2 PCR-RFLP电泳结果

扩增后的目的基因片段长度为509 bp，若基因型为CC，则存在一个酶切位点DpnI（GA/TC），经过酶切产生2个片段，分别为384 bp及124 bp；若发生变异（C＞T），则杂合子基因将产生3个片段，509 bp、384 bp及124 bp；若基因型为TT，则酶切后表现为单条带509 bp，见图1。

表1 2组患者各项临床指标比较Tab.1 Comparison of clinical indexes between the CR and NCR groups

2.3 H-W平衡检验

图1 PCR-RFLP电泳结果Fig.1 Electrophoresis results for PCR-RFLP

通过H-W平衡检验计算，P = 0.995，说明ABCB1 rs1045642位点基因型频率分布符合H-W平衡（P ＞0.05），即本实验选择的样本基因频率分布有群体代表性，适合进行遗传学分析。

2.4 标签SNP基因型以及等位基因频率分布

CR组和NCR组ABCB1基因单核苷酸多态位点rs1045642同时存在3种基因型：CC、TT与CT，基因型频率分别为20.0%、34.3%、45.7%和41.3%、9.04%、49.3%。3种遗传模式（显性、隐性及共显性）下与NCR组比较，CR组TT基因型频率明显增高（P ＜ 0.01）；同时，在rs1045642位点中，CR组携带T等位基因的频率显著高于NCR组（P = 0.001）。CR组和NCR组ABCB1基因单核苷酸多态位点rs1045642在等位基因以及基因型分布方面均表现出统计学差异（P ＜ 0.05）。见表2。

表2 ABCB1基因标签SNP基因型及等位基因频率分布 ［n （%）］Tab.2 Genotype and allele frequency distribution for the ABCB1 SNP ［n （%）］

3 讨论

因为存在CR，临床上仍可见到较多的缺血事件再发。因此，已有学者［10］研究CR与基因多态性间的潜在关系。影响氯吡格雷药物体内吸收代谢的2个主要基因是ABCB1和CYP2C19， CYP2C19已经证实和CR有关［11］。有研究［12］指出，氯吡格雷给药应根据患者的不同情况及临床特点决定，这样有助于对可能出现药物抵抗的患者进行区分。

P-糖蛋白（P-gp）是一种依赖于ATP在药物转运中发挥作用的膜蛋白［13］。其作为外排泵可对抗有机阳离子、氨基酸、多糖和蛋白质等物质而发挥细胞保护作用［14］。ABCB1基因有50多个单核酸多态性位点存在，可以通过对P-gp蛋白表达的直接调控影响氯吡格雷的吸收、代谢。因此，ABCB1基因多态性可能是CR发生的一个因素。目前ABCB1基因的多个SNPs中rs1045642（C3435T）位点受到研究者的广泛关注，但结论并不统一［15-17］。在印度卒中人群ABCB1基因位点C3435T与阿司匹林抵抗的研究中，C3435T TT基因型携带者发生阿司匹林抵抗的风险明显升高［15］。研究［16］发现，携带ABCB1基因rs1045642位点TT基因型的患者在服用氯吡格雷后再发性缺血事件发生的概率较高，而携带野生型CC基因型患者复发率没有增加，与此相反，另一项研究［17］报道，野生型CC基因型个体氯吡格雷治疗后具有更高的复发性缺血性事件风险。但是，这些早期的研究主要集中在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者而不是IS患者。

本研究所得结果提示CR的发生与高血压、吸烟、LDL-C等因素并无明显相关性。选取ABCB1的1个标签SNP，对其与CR患者进行关联性研究，数据表明，在ABCB1基因单核酸多态位点rs1045642检测中，CR组患者中携带 T等位基因的频率明显高于NCR组（P = 0.001）。在3种遗传模式（显性、隐性及共显性）下，CR组TT基因型频率相比于NCR组明显升高。因此，ABCB1基因多态性位点rs1045642（C3435T）可能与CR发生存在相关性。

本研究尚不能完全排除样本的选择导致的结果差异，同时可能存在其他因素影响氯吡格雷吸收、代谢；另外，CR的实验室诊断方法主要是血小板聚集功能的测定，且目前尚缺乏统一的诊断标准。如果能建立一种可靠的预测方法，预先对筛选出的CR高发患者进行特殊干预，及时调整抗血小板药物，对IS患者的预后改善有很大的积极意义。通过对CR以及ABCB1基因多态性之间关系探讨，进一步证实基因多态性这个内在因素在CR发生中的作用，为临床医生选择抗血小板聚集药物提供一定的理论依据。

［1］ 中华医学会神经病学分会，中华医学会神经病学分会脑血管病学组. 中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014［J］.中华神经科杂志，2015，48（4）：246-257. DOI：10.3760/cma.j.issn.1006-7876.2015.04.002.

［2］ ADAMS RJ，ALBERS G，ALBERTS MJ，et al. Update to the AHA/ASA recommendations for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack ［J］. Stroke，2008，39（5）：1647-1652. DOI：10.1161/STROKEAHA.107.189063.

［3］ SIMON T，VERSTUYFT C，MARY-KRAUSE M，et al. Genetic determinants of response to clopidogrel and cardiovascular events［J］ . N Engl J Med，2009，360（4）：363-375. DOI：10.1056/NEJMoa0808227.

［4］ GURBEL PA，BECKER RC，MANN KG，et al. Platelet function monitoring in patients with coronary artery disease ［J］. J Am Coll Cardiol，2007，50（19）：1822-1834. DOI：10.1016/j.jacc.2007.07.051 .

［5］ SABATINE MS，CANNON CP，GIBSON CM，et al. Addition of clopidogrel to aspirin and fibrinolytic therapy for myocardial infarction with ST-segment elevation ［J］. N Engl J Med，2005，352（12）：1179-1189. DOI：10.1016/j.accreview.2005.05.016 .

［6］ BOUMAN HJ，PARLAK E，VAN WERKUM JW，et al. Which platelet function test is suitable to monitor clopidogrel responsiveness? A pharmacokinetic analysis on the active metabolite of clopidogrel ［J］.J Thromb Haemost，2010，8（3）：482-488. DOI：10.1111/j.1538-7836.2009.03733.x.

［7］ 周超飞，任艺虹，宋玉乔，等. ATP结合盒亚家族B运载体1和细胞色素P450 2C19基因多态性与急性冠状动脉综合征介入治疗后氯吡格雷疗效的关系［J］. 中华心血管病杂志，2016，44（4）：309-314. DOI：10.3760/cma.j.issn.0253-3758.2016.04.007.

［8］ 陈碧莲，解勤之，李清，等. 急性冠脉综合征患者氯吡格雷抵抗与近期疗效的临床观察［J］. 中国临床药理学与治疗学，2009，14（3）：328-332.

［9］ TAUBERT D，VON BECKERATH N，GRIMBERG G，et al. Impact of P-glycoprotein on clopidogrel absorption ［J］. Clin Pharmacol Ther，2006，80（5）：486-501. DOI：10.1016/j.clpt.2006.07.007.

［10］ DELANEY JT，RAMIREZ1 AH，BOWTON E，et al. Predicting clopidogrel response using DNA samples linked to an electronic health record ［J］. Clin Pharmacol Ther，2012，91（2）：257-263.DOI：10.1038/clpt.2011.221 .

［11］ YANG J，ZHAO HD，TAN J，et al. CYP2C19 polymorphism and antiplatelet effects of clopidogrel in Chinese stroke patients ［J］. Pharmazie，2013，68（3）：183-186. .

［12］ SU JF，HU XH，LI CY. Risk factors for clopidogrel resistance in patients with ischemic cerebral infarction and the correlation with ABCB1 gene rs1045642 polymorphism ［J］. Exp Ther Med，2015，9（1）：267-271. DOI：10.3892/etm.2014.2058.

［13］ 王召月，王雁，隋爱华，等. 多药物耐药基因多态性与缺血性脑卒中患者阿司匹林抵抗的相关性［J］. 中华医学杂志，2016，96（47）：3819-3824. DOI：10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.47.011.

［14］ PONGSTAPORN W，PAKAKASAMA S，CHAKSANGCHAICHOTE P，et al. MDR1 C3435T and C1236T polymorphisms：association with high-risk childhood acute lymphoblastic leukemia ［J］. Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（7）：2839-2843. DOI：10.7314/APJCP.2015.16.7.2839.

［15］ SHARMA V，KAUL S，AL-HAZZANI A，et al. Association of C3435T multi drug resistance gene-1 polymorphism with aspirin resistance in ischemic stroke and its subtypes ［J］. J Neurol Sci，2012，315（1/2）：72-76. DOI：10.1016/j.jns.2011.11.027.

［16］ MEGA JL，CLOSE SL，WIVIOTT SD，et al. Genetic variants in ABCB1 and CYP2C19 and cardiovascular outcomes after treatment with clopidogrel and prasugrel in the TRITON-TIMI 38 trial：a pharmacogenetic analysis ［J］. Lancet，2010，376（9749）：1312-1319.DOI：10.1016/S0140-6736（10）61273-1.

［17］ WALLENTIN L，JAMES S，STOREY RF，et al. Effect of CYP2C19 and ABCB1 single nucleotide polymorphisms on outcomes of treatment with ticagrelor versus clopidogrel for acute coronary syndromes：a genetic substudy of the PLATO trial ［J］. Lancet，2010，376（9749）：1320-1328. DOI：10.1016/S0140-6736（10） 61274-3.

（编辑 武玉欣）

The Correlation between the ABCB1 rs1045642 Polymorphism and Clopidogrel Resistance among Chinese Han Patients with Ischemic Stroke

HU Pan，WANG Jialu，HE Zhiyi

（Department of Neurology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between the ABCB1 rs1045642 polymorphism and clopidogrel resistance （CR）among Chinese Han patients with ischemic stroke.MethodsIn total，110 patients with acute ischemic stroke were included in the study.Venous blood samples （2 mL） were collected after oral administration of 75 mg/d clopidogrel；the platelet aggregation rate was measured before clopidogrel administration and after 7 days of clopidogrel administration. CR is defined as no more than 10% change in the platelet aggregation rate over two times . Based on the results，patients were divided into the CR group and non-CR （NCR） group. Genomic DNA was extracted，the target gene was amplified by PCR，and the SNP was determined by RFLP.ResultsThe TT genotype frequency of ABCB1 rs1045642 was significantly higher in the CR group than in the NCR group （P = 0.003）. T allele carriers in CR group show much more （57.1% vs 34%，P = 0.001） compared with those in the NCR group.ConclusionThe ABCB1 rs1045642 polymorphism may be an independent risk factor and the T allele may be a gene indicating risk for CR among Chinese Han patients with ischemic stroke.

ischemic stroke； ABCB1 gene； single nucleotide polymorphism； rs1045642； clopidogrel resistance

R743.3

A

0258-4646（2017）11-1019-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.013

胡畔（1987-），女，助教，硕士.

何志义，E-mail：hezhiyi0301@sina.com

2017-03-03