响应面分析法优化超声提取党参皂苷的工艺研究

2017-11-04王婧刘慧婷柴庆凯郝象瑢李二峰池明刘慧芹王远宏

天津农业科学 2017年10期

王婧++刘慧婷++柴庆凯++郝象瑢++李二峰++池明++刘慧芹++王远宏

摘要：以党参皂苷得率为衡量指标，考察了影响超声提取党参皂苷的4个因素：料液比、乙醇的质量分数、超声时间及超声功率。在单因素试验基础上，通过3因子3水平的响应面分析法进行试验，对各因子显著性和交互作用进行分析。结果表明，超声提取党参皂苷的最佳工艺条件为乙醇质量分数74.81%、超声时间39.38 min、超声功率195.10 W；该条件下党参皂苷的得率为2.589 7%。考虑到实际的操作性，以乙醇质量分数74%、超声时间39 min、超声功率200 W为条件，得到实际党参皂苷平均得率为2.564 7%，与理论值相差较小，说明该工艺条件具有实际操作性和可行性。

关键词：党参皂苷；响应面法；超声提取

中图分类号：TS202.3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.10.004

Study on Optimization of Ultrasonic Extraction of Saponin from Codonopsis pilosula by Response Surface Method

WANG Jing， LIU Huiting， CHAI Qingkai， HAO Xiangrong， LI Erfeng， CHI Ming， LIU Huiqin， WANG Yuanhong

（College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract：In this research， the four factors of ultrasonic extraction of Codonopsis pilosula saponins were studied， including the ratio of material to liquid， the mass fraction of ethanol， ultrasonic time and ultrasonic power. On the basis of single factor experiment， the response surface analysis method of three factors and three levels was used to analyze the significance and interaction of each factor. The results showed that the optimum extraction conditions of ultrasonic extraction of Codonopsis pilosula saponins were mass fraction of ethanol 74.81%， ultrasonic time 39.38 min， ultrasonic power 195.10 W， and yield of the saponins at the optimized condition was 2.589 7%. Considering the actual operation， using the mass fraction of ethanol 74%， ultrasonic time 39 min， and ultrasonic power 200 W as the best condition， the actual average yield was 2.564 7%. The difference between the actual value and the theoretical value was very small， and it was concluded that the condition was practical and feasible.

Key words： saponin of Codonopsis pilosula； response surface method； ultrasonic extraction

党参[Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf]属桔梗科党参属植物，别名有防风党参、狮头参、中灵草、上党参、黄参、防党参、黄党。党参是我国传统的名贵药材，开始出现于清代本草，是当山西人参资源逐渐衰败时被作为上党人参上市出现的[1]。党参提取物含有皂苷、淀粉、蔗糖、维生素B2、葡萄糖、菊糖、黏液挥发油、黄芩素葡萄糖苷、微量生物碱及树脂等66种[2]。近年来，在原有科研的基础上，国内或国外均对党参的化学成分进行了刻苦的钻研，并从党参中分离鉴定出了21种糖苷类，13种三萜类，34种挥发油成分及含氮成分，5种生物碱类，10种甾醇类及人类所必需的氨基酸和无机成分[3-5]。

皂苷因为其水溶液振摇后可以生成胶体溶液，并具有持久性的类似于肥皂溶液的泡沫而得名，分为三萜皂苷和甾體皂苷[6]。皂苷具有许多药理学功能：抗肿瘤[7-8]、抗炎[9]、抗病毒、免疫调节[10]、降血糖[11]、降低胆固醇[12]、抗菌[13]和防治心血管疾病[14]。一些富含皂苷的植物提取物大量被用于制造发泡剂、洗洁剂和乳化剂等。皂苷是结构复杂自然而然产生的化合物，它被认为对冷血动物是有毒的，然而对哺乳类动物的口服毒性却很低。食品中天然存在的皂苷无毒，甚至可能对人类饮食有益。

皂苷的提取是利用溶剂进入到药材，使有效成分从固相转移到液相，再将不溶性固体和溶液分开的过程。传统提取方法有溶剂提取法和水蒸汽蒸馏法，但随着科学技术的发展，一批新技术、新设备也应运而生，如大孔吸附树脂法、超声波萃取、超临界CO2流体萃取、浸渍法、渗漉法、回流法、正丁醇萃取法、异丙醇溶解重结晶法、氧化铝柱法、微波辅助提取技术等[15]。其中，超声波提取与传统的提取方法相比，具有相当的优越性，如超声波提取的效率高，中药成分提取充分，提取率比传统工艺要高50%～500%；提取的时间短，比之传统工艺至少缩短2/3以上；提取的温度低，最佳的温度在40～60 ℃；适应性非常广，其不受成分的极性、分子量大小的限制；提取的药液杂质少，易于分离纯化有效的成分；运行成本低经济效益非常显著；操作简便易行等[16]。超声提取技术在中药领域中应用广泛，可用于药材中黄酮类、生物碱类、多糖类等物质的提取，超声提取中药的工艺研究较为丰富，但仍需完善。endprint

本研究以人参皂苷作为标准品，利用响应面法对超声提取党参皂苷进行分析，在单因素试验的基础上，选择料液比、乙醇的质量分数、超声时间及超声功率4个因子，选取其中3个影响较大因子作为自变量，以党参皂苷得率作为响应值，利用响应面分析法，研究各自变量之间的交互作用及其对党参皂苷得率的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型，并确定超声提取党参皂苷的最佳条件。

1 材料和方法

1.1 试验材料

党参药材购于山西省运城市药材公司，其出产于甘肃文县栽培的纹党参。将其置于60 ℃电热鼓风干燥箱中进行干燥，使其含水量小于5%，将烘干的样品研磨成粉末状，过直径0.25 mm的筛子后保存备用。

1.2 仪器与试剂

LC-2008型智能温控低温超声波萃取仪（常州恩培仪器制造有限公司），DK-8D型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司），UV-1800紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），RE52AA型旋转蒸发仪（上海越磁电子科技有限公司），SHZ-DIII型循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），WGL-65B型电热鼓风干燥箱（上海天呈科技有限公司），FZ102型微型植物试样粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）。

无水乙醇、无水甲醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸、正丁醇试剂均为分析醇；购买的人参皂苷标准品Rg1出产于上海源业生物科技有限公司（≥98%）。

1.3 试验方法

1.3.1 人参皂苷标准曲线的绘制精确称取人参皂苷Rg1 10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀后即可得到1 mg·mL-1的人参皂苷标准液。用移液枪准确吸取标准液30，60，90，120，

150，180 μL于试管中，水浴挥干溶剂，加入5%的香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，摇匀后，在60 ℃水浴加热15 min，取出后用冰水冷却5 min，加冰乙酸10 mL稀释，在554 nm波长处测定吸光度[17]，作线性回归标准曲线。

1.3.2 党参总皂苷的提取与测定

1.3.2.1 党参总皂苷的提取精确称取党参粉末2.0 g，置于100 mL锥形瓶中，按1∶20的料液比加入70%质量分数乙醇溶液于索式提取器上加热回流30 min，加入蒸馏水定容至50 mL，在70 ℃，150 W功率下提取30 min，过滤提取液，即得皂苷粗提液。

1.3.2.2 总皂苷得率的计算在党参粗提液中加入等体积正丁醇萃取，收集上层正丁醇相，于旋转蒸发仪中进行减压蒸馏，取0.5 mL无水甲醇溶解浸膏，置于试管中，加入5%的香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，摇匀后，在60 ℃水浴锅中加热15 min，取出后用冰水冷却5 min，加冰乙酸定容至100 mL稀释，在554 nm波长处测定吸光度，按照标准曲线计算出党参总皂苷质量，并按下述公式计算总皂苷的得率。

总皂苷得率=提取的皂苷质量÷党参粉末质量×100%（1）

1.3.3 单因子对超声波法提取党参皂苷含量的影响将乙醇作为提取溶剂，研究乙醇质量分数、超声时间、超声功率及料液比4个单因子对总皂苷得率的影响。

1.3.3.1 乙醇质量分数对党参皂苷得率的影响精确称取2 g党参粉末5份，置于索式提取器上加入50%，60%，70%，80%，90%共5个质量分数梯度乙醇加热回流30 min，料液比为1∶20，加入蒸馏水定容至50 mL，在70 ℃，150 W下超声提取30 min，过滤，收集等体积正丁醇萃取，收集上层正丁醇相，于旋转蒸发仪中进行减压蒸馏，取0.5 mL无水甲醇溶解浸膏，置于具塞试管中，如1.3.2.2方法处理测定吸光度，以上步骤重复3次，选出较佳的乙醇质量分数。

1.3.3.2 料液比对党参皂苷得率的影响精确称取2 g党参粉末5份，置于索式提取器上加入70%质量分数乙醇加热回流30min，料液比分别为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，加入蒸馏水定容至50 mL，在70 ℃，150 W下超声提取30 min，过滤，加入等体积正丁醇萃取，收集上层正丁醇相，于旋转蒸发仪中进行减压蒸馏，取0.5 mL无水甲醇溶解浸膏，置于试管中，如1.3.2.2的方法处理测定吸光度，以上步骤重复3次，选出最佳的料液比。

1.3.3.3 超声功率对党参皂苷得率的影响精确称取2 g党参粉末5份，置于索式提取器上加入70%质量分数乙醇加热回流30 min，料液比为1∶20，加入蒸馏水定容至50 mL，在70 ℃下超声提取30 min，超声功率分别为100，150，200，250，300 W共5個梯度，过滤，加入等体积正丁醇萃取，收集上层正丁醇相，于旋转蒸发仪中进行减压蒸馏，取0.5 mL无水甲醇溶解浸膏，置于试管中，如1.3.2.2的方法处理测定吸光度，以上步骤重复3次，选出最佳的超声功率。

1.3.3.4 超声时间对党参皂苷得率的影响精确称取2 g党参粉末5份，置于索式提取器上加入70%质量分数乙醇加热回流30 min，料液比为1∶20，加入蒸馏水定容至50 mL，分别在70 ℃，150 W下超声提取20，30，40，50，60 min，过滤，加入等体积正丁醇萃取，收集上层正丁醇相，于旋转蒸发仪中进行减压蒸馏，取0.5 mL无水甲醇溶解浸膏，置于试管中，如1.3.2.2的方法处理测定吸光度，以上步骤重复3次，选出最佳的超声时间。

1.3.4 响应面法优化试验结合单因子的试验结果和Box- Benhnken中心组合设计原理，采用响应面法在3因子3水平上对超声提取党参皂苷的工艺条件进行优化，以选取的3因子为自变量，皂苷提取得率（R1）为因变量，对试验数据进行多项式拟合回归，利用Design Expert v8.0.6软件，结合响应面回归方程分析数据，建立皂苷得率的回归模型，寻找出其中最优的反应条件，并对本试验进行可信度以及3因子之间的交互作用分析。endprint

1.3.5 优化条件的模型验证由Design Expert v8.0.6软件分析得到的皂苷得率最大响应面值R1时对应的3因子最佳工艺条件，运用1.3.2提取皂苷的试验方法，通过进行3次重复试验得到实际皂苷得率均值，对优化条件进行验证。

2 结果与分析

2.1 人参皂苷标准曲线

以皂苷取样量为横坐标，以吸光度为纵坐标，得到人参皂苷标准曲线如图1所示。其线性回归方程为y=0.002 4x+0.157 1（R2=0.999 7）。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇质量分数对党参皂苷得率的影响在液料比20∶1，70 ℃，150 W下超声提取30 min的条件下，不同乙醇质量分数对总皂苷得率的影响结果如圖2所示。

由图2可知，在同样条件下，乙醇质量分数在50%～70%时，皂苷的得率随乙醇质量分数的增加而逐步增大，70%之后有所下降。这是由于50%～70%乙醇质量分数增加时，党参中的皂苷溶出量增加，总皂苷得率也相应提高，70%之后乙醇质量分数过高，脂溶性成分溶出增多，一些小分子物质溶于溶液，使得党参皂苷的得率不再升高。因此，乙醇质量分数在70%时，皂苷提取效果较好。

2.2.2 料液比对党参皂苷得率的影响在乙醇质量分数70%，70 ℃，150 W下超声提取30 min的条件下，不同料液比对总皂苷得率的影响结果如图3所示。

由图3可知，在相同条件下，液料比小于25∶1时，皂苷得率随料液比增加而增大。这是由于液料比小于25∶1 时，党参皂苷不能完全提取出来，液料比大于25∶1时，由于提取的皂苷总量已经达到最大值，当乙醇体积量增大，皂苷得率趋于平缓。考虑到经济合理，所以液料比取25∶1为宜。

2.2.3 超声功率对党参皂苷得率的影响在料液比20∶1，乙醇质量分数70%，70 ℃下超声提取30 min的条件下，不同超声功率对总皂苷得率的影响结果如图4所示。由图4可知，在相同条件下，超声功率从100 W增大到200 W时，随超声功率的增大总皂苷得率逐渐升高。这是由于小于200 W时皂苷提取不充分，但200 W以后，因其他脂溶性物质溶出，皂苷得率明显下降。因此，超声功率选200 W为宜。

2.2.4 超声时间对党参皂苷得率的影响在液料比20∶1，乙醇质量分数70%，70 ℃，150 W的超声条件下，不同超声时间对总皂苷得率的影响结果如图5所示。

由图5可知，在相同条件下，党参皂苷超声时间为40 min时得率最高。这是由于超声时间小于40 min时，党参皂苷不能完全溶解出来，但时间过长，其他脂溶性物质被提取出来，影响提取的党参皂苷纯度，使得皂苷得率有所下降。因此，超声时间选40 min为宜。

综合分析可知，在乙醇质量分数、超声时间、料液比、超声功率4个因子中，乙醇质量分数、超声功率、超声时间对皂苷得率的影响较大，而料液比影响较小。故而，取乙醇质量分数、超声功率、超声时间作为响应面法的影响因子。

2.3 响应面法优化试验结果

2.3.1 因子与水平的选取及分析方案的试验结果结合单因子的试验结果和 Box- Benhnken中心组合设计原理，采用响应面法在3因子3水平上对超声提取党参皂苷的工艺条件进行了优化，响应面法分析各因子和水平如表1所示。

2.3.2 响应面分析方案的试验结果对试验数据进行多项式拟合回归，响应面法分析的试验结果如表2所示。以超声时间（A），乙醇质量分数（B），超声功率（C）为自变量，以皂苷提取得率（R1）为因变量，得到试验实际的响应面回归方程。

R1=-62.337 35+0.773 95×A+0.918 15×B+0.157 29×C-0.000 978 75×A×B-0.000 091 3×A×C-0.000 135 35×B×C-0.008 670 25×A2-0.005 702 5 ×B2 -0.000 367 95×C2 （1）

2.3.3 回归模型参数分析利用方程Design Expert v8.0.6软件，结合响应面回归分析数据，建立皂苷得率的回归模型，以找出其中最优的反应条件。其回归模型参数分析结果如表3所示。

由表3可知，模型的F值为89.03，表明模型极显著，模型中的F值仅仅有0.01%的机会发生，当模型中P>F值，小于0.05时，表示该因子影响显著，在这种情况下，B，C，A2，B2，C2各模型因子影响极显著，表示各试验因子对响应值不是单纯的线性关系，因子间的交互作用比较小，并与一次项不显著，二次项极显著相符合。失拟项是1.29，说明失拟项相对于纯误差是不显著的，失拟项的F值仅有39.26%的机会发生，失拟项不显著是很好的一个模型。

2.3.4 可信度分析利用Design Expert v8.0.6软件，结合响应面回归方程分析数据，对本试验进行可信度分析，分析数据如表4所示。

由表4可知，预测拟合度值为0.925 0，校正的决定系数的平方R=0.980 2，表明98.02%的试验数据可用此模型进行分析，而且方程可靠性较高。CV值越低，表明试验的稳定性越好，可信度越高。本试验的变化系数CV值为8.95，相对较低，具有可信度。信噪比大于4时模型具有可信度，此次试验的信噪比为22.876，其可信度较高。综上分析，本试验具有实践价值。

2.3.5 交互作用分析

2.3.5.1 超声时间与乙醇质量分数交互作用分析由图6可知，在固定超声功率的条件下，超声时间和乙醇质量分数交互作用，当超声时间一定时，皂苷得率随着乙醇质量分数的提高而呈现先增后减的趋势，但不显著；而当乙醇质量分数一定时，皂苷得率随超声时间的延长而呈现先增后减的趋势，且较显著。endprint

2.3.5.2 乙醇质量分数与超声功率由图7可知，在固定超声时间的条件下，超声功率和乙醇质量分数交互作用，当超声功率一定时，皂苷得率随着乙醇质量分数的提高而呈现先增后减的趋势，但不显著；而当乙醇质量分数一定时，皂苷得率随超声功率的增大而呈现先增后减的趋势，且较显著。

2.3.5.3 超声时间与超声功率由图8可知，在乙醇质量分数固定的条件下，超声时间和超声功率交互作用，当超声时间一定时，皂苷得率随着超声功率的增大而呈现先增后减的趋势，且较显著；而当超声功率一定时，皂苷得率随超声时间的延长而呈现先增后减的趋势，也较显著。

2.4 优化条件的模型验证

由Design Expert v8.0.6软件分析得到的皂苷得率最大响应面值Rg1对应的A、B、C最佳工艺条件是：超声时间39.38 min，乙醇质量分数74.81%，超声功率195.10 W，此时皂苷的得率是2.589 7%。为了验证响应面法的可靠性，同时考虑到实际生产操作的便利性，对得到的最佳提取工艺条件进行党参皂苷超声提取的验证试验，以超声时间39 min，乙醇质量分数74%，超声功率200 W为提取条件，3次平行试验得到的实际平均皂苷得率为2.564 7%，与理论值2.589 7%相差0.025 0%。因此，通过响应面法优化得到的党参皂苷的超声提取工艺条件是可行的，具有实际应用价值。

3 讨论与结论

邹静恂等[18]运用超声波法提取党参皂苷，比较超声时间对党参皂苷得率的影响，结果发现，当超声时间为50 min时，皂苷得率达到1.822 5%，是常规提取法的2倍。而本研究选取了料液比、乙醇浓度、超声时间及超声功率4个参数进行单因素分析，选出了超声时间、乙醇浓度、超声功率3个影响较大的因子进行试验，得出的最佳提取工艺条件是：超声时间39.38 min，乙醇质量分数74.81%，超声功率195.10 W，此条件下，党参皂苷得率为2.589 7%，与实际测得的党参皂苷得率相符，与邹静恂等[18]的研究结果相比，缩短了提取时间，同时提高了党参皂苷的提取率。因此，本试验通过响应面法优化得到的党参皂苷的工艺条件可行、方便，并具有实际应用价值。

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