李朋朋，吴运东，叶 嘉，李丹花，乔莉娟，张玉星，董金皋

(1.邯郸学院 生命科学与工程学院，河北 邯郸 056005；2.河北农业大学，河北 保定 071001 )

鸭梨PbChiⅡ的克隆与表达分析

李朋朋1，吴运东1，叶 嘉1，李丹花1，乔莉娟1，张玉星2，董金皋2

(1.邯郸学院 生命科学与工程学院，河北 邯郸 056005；2.河北农业大学，河北 保定 071001 )

为明确几丁质酶在鸭梨抗病过程中的作用，以鸭梨为试材，提取总RNA，采用RT-PCR方法克隆几丁质酶基因PbChiⅡ，分析PbChiⅡ在梨黑星病菌诱导下的表达模式，构建原核表达载体pET30a-PbChiⅡ，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达PbChiⅡ蛋白，分析重组蛋白在非生物胁迫下的生长能力。结果表明：PbChiⅡ基因全长(基因登录号：KP876485)969 bp，实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)分析显示，PbChiⅡ基因的表达受病原菌的调控，在供试的96 h内，梨黑星病菌可诱导该基因表达，且表达量在48 h达到最高。将PbChiⅡ基因成功克隆到原核表达载体pET30a上，SDS-PAGE分析表明，该重组蛋白在37 ℃，1.0 mmol/L IPTG诱导2 h，表达量最大。转pET30a-PbChiⅡ载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达了分子量约35.53 kDa的重组蛋白。诱导的蛋白可增强菌体在NaCl、CuCl2、CdCl2和ZnSO4等非生物胁迫下的生长能力。为进一步探索PbChiⅡ基因的功能提供了基础资料。

鸭梨；几丁质酶基因；原核表达；非生物胁迫；表达模式

几丁质酶 (Chitinase，Chi)作为一类病程相关蛋白，是植物遭受生物因素和非生物因素后诱导并产生的[1-3]。

目前已知的植物几丁质酶都属于小分子蛋白，分子量为25～40 kDa，最适pH值为6.0，多数以单体形式存在，50 ℃下仍稳定存在并保持酶活性，等电点为3～10[4-6]。细胞内、外均有分布，等电点偏酸或偏碱，常被称为酸性几丁质酶或碱性几丁质酶。很多动物、植物、微生物都可产生几丁质酶。……