李兆亭，林涛，申基雪，陈文学，孙志昶，*

（1.海南大学食品学院，海南海口570100；2.海南舒普生物科技有限公司，海南海口570100）

迷迭香对冷鲜肉抑菌及其保鲜作用的影响

李兆亭1，林涛2，申基雪2，陈文学1，孙志昶1，*

（1.海南大学食品学院，海南海口570100；2.海南舒普生物科技有限公司，海南海口570100）

冷鲜肉营养丰富，但在储藏过程中容易受到微生物的污染而引起腐败变质，货架期缩短。主要研究迷迭香酸（RAP）和乳酸链球菌素（Nisin）及其复合保鲜剂对冷鲜猪肉的保鲜作用，综合菌落总数、挥发性盐基氮（TVB-N）、大肠菌群MPN值和pH值等指标评价其保鲜效果。结果发现，RAP20（RAP≥20%）和Nisin对菌落总数和大肠菌群MPN值抑制作用显著（p<0.05），在冷藏的5 d～9 d可显著抑制汁液损失和pH值的升高（p<0.05）。研究表明，RAP20、Nisin及其复合保鲜剂抑菌效果显著，可使货架期延长3 d～5 d，同时复合而成的保鲜剂可显著降低保鲜剂的使用量，这为以后研究迷迭香和Nisin对冷鲜肉保鲜机制提供理论依据。

迷迭香酸；乳酸链球菌素；冷鲜肉；抑菌剂

随着生活水平不断提高，人们对食品安全与营养的要求越来越高，冷鲜肉以其安全性高、脂肪含量低和蛋白质含量高等品质越来越受到人们的青睐[1]，但在储藏、销售等过程中容易受到微生物的污染而引起腐败变质，货架期缩短。目前在食品保鲜方面，市场上占主导地位的是化学保鲜剂，但随着医学毒理学和生物学研究的不断深入发现，大多化学保鲜剂对人体都有不同程度的伤害，与之相比，天然保鲜剂的毒性远远低于化学保鲜剂的毒性，且抑菌效果显著。

迷迭香提取物主要通过清除自由基、螯合金属离子和还原能力而起到抗氧化作用，其主要成分包括迷迭香酸（Rosmarinic acid，RAP）、鼠尾草酸（Carnosic acid，CAP）、绿原酸和咖啡酸，其中RAP属于天然抗氧化剂，具有显著抑菌能力以及能够有效降低脂肪和蛋白质的氧化程度[2-4]。与茶多酚相比，迷迭香成为近年食品加工中的重要天然保鲜剂及抗氧化剂[5]。有研究报道，RAP对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有强抑制作用[6]，RAP可以抑制金黄色葡萄球菌（S.aureus）的生长和生物膜的形成，能够使葡萄糖基转移酶的活性降低，使细菌正常的糖代谢过程受到干扰而抑制生长。另外，乳酸链球菌素（Nisin）也是常用的食品保鲜剂，它主要是对革兰氏阳性菌和部分孢子菌起抑制作用，其通过细胞膜上磷脂的静电作用而被吸附，并在细胞膜上形成小孔增加细胞膜的通透性，造成胞内大量小分子物质流失，而起到抑菌作用。López-Mendoza等[7]的研究表明Nisin对畜肉的李斯特菌、热死环丝菌等致病菌有良好的抑制效果。

在冷鲜肉保鲜方面，国内外学者对迷迭香和Nisin的保鲜效果均有一定的研究。但是具体到迷迭香中何种成分起作用以及与Nisin结合的保鲜效果，国内外鲜有报道。因此，本文主要研究RAP20和Nisin及其复合保鲜剂对冷鲜猪肉的保鲜作用，综合菌落总数、挥发性盐基氮（TVB-N）、大肠菌群MPN值和pH值等指标评价其保鲜效果，为以后研究迷迭香和Nisin对冷鲜肉保鲜机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

试验样品（冷鲜猪肉）：海南省罗牛山股份有限公司提供，三元猪经屠宰后选取背最长肌（ML），除去脂肪和结缔组织后分成若干块；RAP20：海南舒普生物科技有限公司；Nisin（分析纯）：浙江新银象生物工程有限公司；PCA培养基：杭州微生物试剂有限公司。

1.1.2 仪器

BIO-DL 移液枪：德国 Eppendorf；KJELTEC2300全自动定氮仪：瑞士福斯特卡托公司；XK97-A菌落计数器、EL602电子分析天平、FE20 pH计：梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理

试验分为5组。第1组：称取0.20 g RAP20（RAP≥20%）溶解后转移至1 000 mL容量瓶，制成质量浓度为0.20 g/L RAP20；第2组称取0.60 g Nisin溶解后转移至1 000 mL容量瓶，制成质量分为0.60 g/L Nisin；第3组：0.20 g/L RAP20+0.60 g/L Nisin；第 4组：0.10 g/L RAP20+0.30 g/L Nisin；对照组：蒸馏水。将已配好的RAP20和Nisin分别喷洒于肉样表面，待其吸收充分后置于保鲜袋中，对照组喷洒等量蒸馏水，在（3±1）℃条件下避光冷藏，在成熟的第1天～9天分别测定相应指标。

1.2.2 菌落总数

参照GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》，取样品10 g并用灭菌剪刀剪碎，放入装有90 mL 0.85%无菌生理盐水锥形瓶中，封口后摇床振摇3 min，然后取1 mL上清液，进行10倍递增稀释，选择合适的稀释度，倾注平板，倒入PCA培养基，在37℃恒温培养箱中恒温培养48 h后计数。

1.2.3 挥发性盐基氮（TVB-N）

参考GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》，取10 g肉切碎搅匀，置于锥形瓶中，加100 mL水，不停振摇，浸渍30 min后过滤，滤液置冰箱备用。预先将盛有10 mL 2%硼酸吸收液并加有5～6滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入锥形瓶内吸收液的液面下，吸取5.0mL上述样品滤液于蒸馏器反应室内，加5 mL1%MgO混悬液，迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸气，待蒸气充满蒸馏器内时即关闭蒸气出口管，由冷凝管出现第一滴冷凝水开始计时，蒸馏5 min即停止，吸收液用0.01 mol/L盐酸标准溶液滴定，终点至蓝紫色。同时做试剂空白试验。

式中：X为试样中挥发性盐基氮的含量，mg/100 g；V1为测定样品消耗盐酸体积，mL；V2为试剂空白消耗盐酸体积，mL；c为盐酸标准溶液的浓度，mol/L；14为与 1.00 mL 盐酸标准溶液[c（HCl）=1.000 mol/L]相当的氮的质量，mg；m为样品质量，g。计算结果保留3位有效数字。

1.2.4 大肠菌群MPN值

按照GB 4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》方法进行计数[8]。

1.2.5 pH值

取样品10 g，剪碎后加入90 mL煮沸过的双重蒸馏水，振荡30 min，过滤，取滤液测定pH值。

1.2.6 汁液损失率

将肉样修整为3 cm×3 cm×3 cm的肉样，称重W1，然后用铁丝钩住肉样一端，使肌纤维垂直向下吊挂在空气中，（3±1）℃的条件下分别测定宰后1 d～9 d的肉样重W2，测定时用滤纸吸去表面残留液体，分别计算汁液损失率/%=（W1-W2）/W1×100。

1.2.7 感官评价

抽取10名感官评定人员，分别对不同处理和不同天数的冷鲜肉的色泽、组织状态和肉汤进行感官评定。评定标准如下。

表1 冷鲜肉感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria of cold meat during storage

1.2.8 统计分析

每组试验进行3次重复试，验数据处理用SPSS19.0分析软件，图形制作用Origin 8.0作图软件。

2 结果与分析

2.1 冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对菌落总数的影响

冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对菌落总数的影响见图1。

图1 冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对菌落总数的影响Fig.1 Effects of total viable count of chilled pork with preservatives during storage

由图1可知，在宰后9d内，不同保鲜剂处理下冷鲜猪肉的菌落总数总体上均呈上升趋势，复合保鲜剂处理组低于单一保鲜剂处理组。在5 d～9 d，除经0.60g/LNisin处理的一组，其它组菌落总数均极显著增加（p＜0.01），对照组菌落总数在第7天已经超过冷鲜肉国家标准（菌落总数大于6.0 lg cfu/g为变质肉），其他组均未超标。在3 d～5 d，经复合保鲜剂处理的肉样菌落总数显著低于单一保鲜剂处理组（p＜0.05），且复合保鲜剂处理组之间差异不显著（p＞0.05）。

2.2 冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对TNB-N的影响

冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对TNB-N的影响见图2。

图2 冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对TNB-N的影响Fig.2 Effects of TNB-N of chilled pork with preservatives during storage

由图2可知，在宰后9 d内，不同保鲜剂处理下冷鲜猪肉的TVB-N均呈上升趋势。在3 d～9 d，不同保鲜剂处理组TVB-N显著低于对照组（p＜0.01），不同保鲜剂处理组之间差异不显著。在第7天对照组TVB-N已经达到冷鲜肉国家标准（TVB-N大于20 mg/100 g为变质肉），其他组均未超标。

2.3 冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对大肠菌群MPN值的影响

冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对大肠菌群MPN值的影响见图3。

图3 冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对大肠菌群MPN值的影响Fig.3 Effects of coliforms MPN value of chilled pork with preservatives during storage

由图3可知，在宰后9 d内，不同保鲜剂处理下冷鲜猪肉的大肠菌群MPN值均呈上升趋势，且均显著低于对照组（p＜0.05），不同保鲜剂处理组之间差异不显著。在第7天对照组大肠菌群MPN值已经超过冷鲜肉国家标准（lg cfu/100 g≤4），其他组均未超标。

2.4 冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对pH值的影响

冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对pH值的影响见图4。

图4 冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对pH值的影响Fig.4 Effects of pH values of chilled pork with preservatives during storage

由图4可知，在宰后9 d内，不同保鲜剂处理下冷鲜猪肉的pH值均呈先下降后上升的趋势，对照组在3 d～9 d显著上升（p<0.01）。在 3 d～9 d，保鲜剂处理组pH值显著低于对照组（p<0.05），经复合保鲜剂处理的pH值稍低于单一保鲜剂处理组，且复合保鲜剂处理组之间差异不显著。

2.5 冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对汁液损失率的影响

冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对汁液损失率的影响见图5。

图5 冷鲜肉储藏过程中添加不同保鲜剂对汁液损失率的影响Fig.5 Effects of of water holding capacity of chilled pork with preservatives during storage

由图5可知，在宰后9 d内，不同保鲜剂处理下冷鲜猪肉的汁液损失率均呈上升趋势，且在3 d～9 d汁液损失率均显著上升（p<0.05），在 5 d～9 d，保鲜剂处理组汁液损失率显著低于对照组（p<0.05）。复合保鲜剂与单一保鲜剂处理组之间汁液损失率差异不显著，但在储藏的3 d～7 d，复合保鲜剂处理组汁液损失率较低。

2.6 冷鲜肉储藏过程中的感官评价

冷鲜肉储藏过程中的感官评价见表2。

表2 冷鲜肉储藏过程中的感官评价Table 2 Sensory evaluation of chilled meat during storage

由表2可以看出，在贮藏2 d内保鲜剂处理组与对照组的冷鲜肉感官品质均未发生显著变化，随着冷藏时间的延长，对照组各项感官得分显著降低。保鲜剂处理组在第9天时还保持了较好的鲜色泽，对照组在第5天肉样已呈褐红色。不同保鲜剂处理组之间感官指标不存在显著差异，但复合保鲜剂处理组略优于单一保鲜剂处理组。

3 讨论

Nisin可吸附于细菌细胞膜表面，造成细胞膜破裂为小孔，使得小分子物质流失二而引起细菌死亡[9]。由图1～图3可知，与对照组相比，添加RAP20和Nisin抑菌作用显著（p<0.05），在冷藏的9 d内菌落总数、大肠菌群MPN值和TVB-N均未超过国家标准。Chung等[10]和López-Mendoza等[7]的研究表明Nisin对畜肉的李斯特菌、热死环丝菌等致病菌有良好的抑制效果。李平等[11]在研究添加不同香辛料提取物对冷藏肉丸菌落总数的影响时表明，调理牛排在放置48 h时后迷迭香处理组样品细菌总数仍低于6 lg cfu/g，对照组达到7.62 lg cfu/g，说明迷迭香可抑制菌落生长。另外程贤等[12]指出RAP除了具有抑菌作用外，还具有抗病毒、抗氧化、抗炎、保护神经系统以及抗辐射抗肿瘤等多种生物活性。在第7天，对照组菌落总数为6.4 lg cfu/g，大肠菌群MPN值为4.3 lg cfu/100 g，均已超标，TVB-N已达19.7 mg/100 g，此时说明此时冷鲜肉已变质。由于细菌和肉中内源酶作用，使得蛋白质分解为氨和胺类等挥发性含氮物质，所以随菌落的增加，TVB-N随之升高，苏平等[13]将保鲜剂添加至冷鲜猪后腿肉中得出保鲜剂可抑制TVB-N的上升速度，减缓肉的腐败，国外学者Silva[14]和Calo[15]等研究者表示迷迭香精油也同样具有较好的抑菌保鲜作用。对照组在第5天菌落总数和TVB-N均已超标，这可能是由于选取的肉样位置不同或者品种不同造成的。

由图4～图5可知，不同保鲜剂处理下冷鲜猪肉的pH值均呈先上升后下降的趋势，不同保鲜剂处理下冷鲜猪肉的汁液损失率均呈上升趋势。宰后初期细胞由于缺氧会进行无氧呼吸，产生乳酸，使得pH值下降，随着保藏时间的延长，细菌大量繁殖分解肉样蛋白质产生氨和胺类等碱性物质使得pH值回升，回升程度在一定程度上反应肉的腐败情况。随着肉样蛋白质被分解，细胞活性被破坏，持水力下降，造成汁液流失。另外保鲜剂处理组pH值和汁液损失率均显著低于对照组，蓝蔚青等[16]指出经Nisin处理后的鱼肉仅在储存后期pH值显著低于对照组，这可能因为样品种类不同以及菌落种类和数量不同。综合所测各项指标，在储藏的第7天对照组肉已变质，而保鲜剂处理组在第9天各项指标均正常，这与感官评价结果基本一致。感官评价中对照组在第7天肉色已为褐红色，并伴有些许异味，肉汤较为混浊，在5 d～9 d保鲜剂处理组各评价指标均显著高于对照组。

余翔等[9]在冷鲜肉天然保鲜剂研究进展中提及将不同的天然保鲜剂进行复配，可发挥其协调效应，不仅可以增强其抑菌效果而且还可以降低单一保鲜剂的使用量，但具体协调机制并未解释，有待进一步研究。本试验得出在冷藏的3 d～9 d复合保鲜剂对冷鲜猪肉的抑菌保鲜效果要优于单一保鲜剂，0.20 g/L RAP20+0.60 g/L Nisin和0.10 g/L RAP20+0.30 g/L Nisin的抑菌保鲜效果差异不显著，但后者使用量仅为前者的一半。宋飞等[17]研究指出复合保鲜剂对冷鲜肉抑菌保鲜和保水效果优于单一保鲜剂，Gao等[18]表示将迷迭香提取物与乳酸链球菌肽混合后处理鲳参鱼，发现鱼片中微生物的生长得到了有效的抑制，品质和货架期也得到改善。

4 结论

冷鲜猪肉在（3±1）℃避光冷藏过程中，RAP20和Nisin对菌落总数和大肠菌群MPN值抑制作用显著（p<0.05），在冷藏的5 d～9 d可显著抑制汁液损失和pH 值的升高（p<0.05），0.20 g/L RAP20+0.60 g/L Nisin和0.10 g/L RAP20+0.30 g/L Nisin的抑菌保鲜效果差异不显著，感官评定结果与所测各项指标一致。综上所述，RAP20、Nisin及其复合保鲜剂可显著提高抑菌保鲜效果，使货架期延长3 d～5 d，同时复合而成的保鲜剂可显著降低保鲜剂的使用量，这为以后研究迷迭香和Nisin对冷鲜肉保鲜机制提供理论依据。

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Effect of Rosemary on Antibacterial and Freshness of Cold Meat

LI Zhao-ting1，LIN Tao2，SHEN Ji-xue2，CHEN Wen-xue1，SUN Zhi-chang1，*
（1.College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570100，Hainan，China；2.Hainan Soper Biotech Co.，Ltd.，Haikou 570100，Hainan，China）

Cold meat is rich in nutrition，but in the storage process susceptible to microbial contamination caused by corruption，shorten the shelf life.The effects of rosmarinic acid （RAP）and Nisin and its preservatives on the freshness of cold pork were studied.The total number of integrated colonies，volatile base nitrogen（TVB-N），coliform bacteria MPN value and pH indicators to evaluate its freshness.The results showed that RAP20（RAP≥20%）and Nisin had significant inhibitory effect on the total number of colonies and MPN of coliform bacteria（p<0.05），and significantly inhibited the loss of juice and pH（p<0.05）in the storage of 5 d-9 d.The results showed that RAP20，Nisin and its compound preservative had significant antibacterial effect，which could prolong the shelf life of 3 d-5 d，and the combination of RAP20，Nisin and its preservative could significantly reduce the use of preservative，which was used to study the effects of rosemary and Nisin to provide a theoretical basis for fresh meat preservation mechanism.

rosmarinic acid；Nisin；cold meat；bacteriostat

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.036

国家自然科学基金（31640061）；海南省自然科学基金（317034）；海南大学科研启动基金资助项目（kyqd1563）

李兆亭（1993—），男（汉），硕士，研究方向：动物食品营养与工程。

*通信作者：孙志昶（1987—），男，副教授，博士，研究方向：畜产品加工。

2017-08-25