孙青松 ， 刘志刚 ， 刘明远 ， 李国江

(1.吉林农业科技学院动物科技学院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.预防兽医学吉林省重点实验室 ， 吉林 吉林 132101 ；3.安庆师范大学生命科学学院 ， 安徽 安庆 246011 ； 4.吉林大学人兽共患病研究所教育部重点实验室 ， 吉林 长春 130062)

混合型鸡马立克病的鉴别及综合诊断

孙青松1,2， 刘志刚3， 刘明远4， 李国江1,2

(1.吉林农业科技学院动物科技学院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.预防兽医学吉林省重点实验室 ， 吉林 吉林 132101 ；3.安庆师范大学生命科学学院 ， 安徽 安庆 246011 ； 4.吉林大学人兽共患病研究所教育部重点实验室 ， 吉林 长春 130062)

为了对吉林某土鸡养殖场发生大规模的肿瘤性疾病进行诊断，经过流行病学调查、临床症状检查、病理剖检及组织学观察，初步诊断为禽白血病和鸡马立克病；进行实验室鉴别诊断，设计特异性引物，利用PCR方法，经过BLAST序列比对，实验结果确定该病为鸡的马立克病，而且同时表现出4种混合型的临床症状。

鸡马立克病 ； 混合型 ； 鉴别 ； 综合诊断

鸡马立克病(MD)是一种鸡的高度接触性淋巴组织增生性传染病，以外周神经、性腺、虹膜、各种内脏器官、肌肉和皮肤的单核性细胞浸润和肿瘤形成为特征，引起该病的病原为疱疹病毒马立克氏病毒(MDV)。马立克病根据发病的部位可分为内脏型、神经型、眼型和皮肤型，其中又以内脏型死亡率最高，临床上常见混合性感染的病例。

马立克病常用的检测方法有临床症状检查、病理解剖学分析以及琼脂扩散试验等。近年来，该病的分子生物学诊断技术也取得了一定的进展。PCR诊断技术包括实时PCR、定量PCR、致瘤株特异性PCR、多重PCR等新技术为该病的流行病学调查、病毒在各组织器官的分布以及与其他肿瘤病毒多重感染的诊断等作出了贡献[1-2〗。

2016年4月吉林某土鸡养殖场发生大规模的肿瘤性疾病，经过流行病学调查、临床观察、病理解剖以及实验室检验，确定该病为鸡的混合型马立克病。

1 流行病学调查

某土鸡散养场引种3 000只，自2月龄开始发病，开始少量死亡，后来陆续发病死亡，母鸡死亡率大于公鸡，至4月龄已死亡1 245只，死亡率41.5%，发病期间曾使用过多种抗生素和抗病毒中药进行治疗，效果不理想。据养殖户介绍此批鸡种购自不同的农户，来源比较分散，有的农户引种时已注射过马立克病毒疫苗，有的农户则未免疫该疫苗。

2 临床症状和病理剖检

病鸡精神委靡，食欲不振，羽毛松乱，常扎堆，拉黄白色稀粪，鸡冠颜色发绀(见中插彩版图1A)；多数鸡表现神经症状，出现肢体瘫痪，并有“劈叉状”姿势，卧于一侧，手触摸病鸡脱水，极度消瘦(见中插彩版图1B)；部分鸡只肉髯、鸡冠部分有小米粒至黄豆大小的白色或黄色肿瘤结节，眼睛出现浑浊发白(见中插彩版图1C)；翻开羽毛，在背部、腹部及大腿肌肉的皮肤处亦有肿瘤结节(见中插彩版图1D、1E)。

病理剖检可见多种脏器出现肿瘤，肿瘤多呈结节性，形状不规则，数量不等，大小不一，略突出于脏器表面，灰白色，切面呈脂肪样。有肿瘤的脏器主要集中在心脏(见中插彩版图1F)、脾脏(见中插彩版图1G)、腺胃(见中插彩版图1H)、肝脏(见中插彩版图1I)、肠道及肌胃等处。部分病例肝脏肿大，外观似“啃咬状”，表面不具有结节性样肿瘤，呈灰白色坏死灶，向脏器里面凹陷，肝脏表面凹凸不平(见中插彩版图1I)。肠道内膜增生，可见大小不等肿瘤性结节。腺胃外观不规则，切开后可见不同大小的结节(见中插彩版图1H)。

3 病理组织学检查

采取病变部位制作石蜡组织切片，H.E.染色后，显微镜下观察组织的病理学变化。结果显示，皮肤下聚集大量淋巴样的细胞及中央坏死灶(见中插彩版图2A)，腺胃黏膜下及复管腺浸润大量的肿瘤细胞(见中插彩版图2B)，肝组织间肿瘤细胞局灶性分布(见中插彩版图2C)，脾脏内肿瘤细胞聚集成团，中央出现坏死灶(见中插彩版图2D)，肠黏膜下层可见大量的肿瘤细胞浸润(见中插彩版图2E)，肾间质散在大量的肿瘤细胞(见中插彩版图2F)。

4 实验室检验

无菌取病鸡的肝脏、脾脏等器官进行处理后提取基因组，用设计的特异性引物进行PCR扩增，扩增的引物如下(鉴于是肿瘤性疾病，所以同时对白血病病毒进行了PCR检测)：MDV-F：5′-ATGCGATGAAAGTGCTATGGAG-3′，MDV-R：5′-ATCCCTATGAGAAAGCGCTTGA-3′，ALV-F：5′-GGATGGTGGCTGACTGTGT-3′，ALV-R：5′-CGAACCAAAGGTAACACACG-3′。

扩增体系为50 μL，其中去离子水28.5 μL，5×Primestar-DNA聚合酶缓冲液10 μL，dNTP 4 μL，primer 1和primer 2各1μL，模板DNA 5 μl，Primestar-DNA聚合酶0.5 μL；扩增条件为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，扩增30个循环后，72 ℃延伸10 min。扩增后取PCR产物4 μL，在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，按照回收试剂盒说明书对产物进行回收，回收后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。PCR扩增结果显示，可得到一条314 bp的目的条带，MDV呈阳性(图3)，白血病病毒结果为阴性；测序结果显示，经BLAST比对后证实检测到的病毒为MDV(gb[HQ149526.1])。

图3 马立克病毒PCR检测结果

5 讨论

在鸡群中，淋巴细胞白血病、网状内皮组织增生症及马立克病均可引起肿瘤的发生，虽然自20世纪60年代末火鸡疱疹病毒疫苗用于生产后，已使得马立克病的发生得到了一定控制[3]，但由于马立克病病毒毒力的不断增强以及疫苗免疫不当等原因，使得免疫鸡群中的马立克病仍时有暴发，这给该病的防治又带来了新的挑战。目前，防治马立克病的重要措施仍是科学使用疫苗，而保持良好的环境卫生和培育抗马立克病的新品系鸡群也具有重要作用。疫苗接种后，最早7 d后才能产生坚强的免疫保护力，在接种后到产生免疫保护力之前应特别注意严防环境污染，以免造成鸡群早期感染马立克病病毒强毒而造成发病[4]。马立克病病毒主要是通过水平传播，尚无垂直传播的有力证据[5]，因此，防止环境的病毒污染，避免雏鸡早期感染最为重要，除定期消毒外，执行鸡群“全进全出”饲养模式也很必要。防治马立克病的同时，加强对其他免疫抑制性疫病的检测和防治，可以更好地提高疫苗的免疫效果。

本次鸡马立克病的暴发可能有以下原因：第一个重要原因就是育雏雏鸡来源于不同的养殖户，疫苗接种不统一，而且个别养殖户可能会忽视免疫疫苗的程序，或者免疫方法不当没有起到免疫保护的作用，这样就会极大增加了该病的发病率。二是此次暴发的马立克病同时表现了内脏型、神经型、眼型和皮肤型4种混合感染，这种现象并不多见，其中又以内脏型死亡率最高，推测该病原毒株可能为强毒株，毒力强，致病作用明显，而且传播可能更迅速。三是由于饲养管理不到位，疫病防范意识差，导致该病的发生。因此应加强该病的防疫工作，选择合适的疫苗和科学合理的免疫程序，此外，对于大部分散养户来说，选择合适的种源也至关重要。

本次病例是鸡马立克病4种临床发病型的混合，4种症状同时出现这是并不多见的。疫病发生后，快速准确的诊断可以帮助养殖场确定最佳的治疗或处理方案，最大程度的减少养殖户的损失，本文通过流行病学调查，临床病理变化观察，实验室检验等方法对该病暴发进行了鉴别诊断，为临床生产解决实际问题提供借鉴和参考，从而有效的防控马立克病的发生。

[1] 丁家波.马立克氏病病毒pp38基因及其上游双向启动子的生物学特性[D].泰安：山东农业大学，2005.

[2] 龚振华，胡国明，蒋文明,等.我国马立克氏病研究进展[J].中国动物检疫，2012，29 (7)：63-65.

[3] Gong Z, Zhang L, Wang J,etal. Isolation and analysis of a very virulent Marek’s disease virus strain in China[J]. Virol J，2013, 5(10): 155.

[4] Tian M，Zhao Y，Lin Y,etal. Comparative analysis of oncogenic genes revealed unique evolutionary features of field Marek’s disease virus prevalent in recent years in China[J]. Virol J， 2011, 8: 121-131.

[5] Geerlig S H, Quan Z S, Suurl,etal. Efficacy and safety of cell associated vaccines against Marek′ s disease virus grown in a continuous cell line from chickens[J]. Vaccine, 2008, 26(44)：55-56.

IdentificationandComprehensiveDiagnosisofHybridChickenMarek’sDisease

SUN Qing-song1,2， LIU Zhi-gang3， LIU Ming-yuan4， LI Guo-jiang1,2

(1.Jilin Agricultural Science and Technology University，Jilin 132101, China;2.Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Jilin Province， Jilin 132101, China;3.College of Life Sciences，Anqing Normal University，Anqing 246011，China；4.Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonoses , Jilin University，Changchun 130062，China)

A big-scale neoplastic diseases broke out in Jilin native farms, and we preliminarily diagnosed the disease as Marek’s disease or Avian leukosis by epidemiological survey, clinical examination, pathologic autopsy and histological observations. And then we confirmed that the disease was Chicken Marek’s disease by laboratory diagnosis using PCR. Meanwhile the disease showed the clinical symptoms of 4 kinds of hybrids.

Marek’s Disease ； Hybrid ； Identification ； Comprehensive Diagnosis

LI Guo-jiang

S858.31

A

0529-6005(2017)08-0029-03

2016-10-28

吉林市科技发展计划资助项目(20166034)；吉林农业科技学院博士启动基金项目(吉农院合字2015第243号)；吉林农业科技学院种子基金项目(吉农院合字2016第Z01号)；吉林农业科技学院校级重点学科培育项目(吉农合字2015第X055号)

孙青松(1982-)，男，讲师，博士,主要从事动物疫病方面的研究，E-mail：sqswjy@163.com 刘志刚(1984-)，男，讲师，硕士，主要从事动物疾病防治的研究，E-mail：xiaozhubingbingxue@ 163.com

注：刘志刚与孙青松对本文具有同等贡献

李国江，E-mail：jlliguojiang@126.com