陈聪，黄春宇，李玉叶，余姝毅，陈伟洪，林升来，杜晨阳，莫美兰

(深圳市中山泌尿外科医院生殖中心，深圳 518043)

反复种植失败患者与复发性流产患者分泌期子宫内膜自然杀伤细胞数量分析

陈聪，黄春宇，李玉叶，余姝毅，陈伟洪，林升来，杜晨阳，莫美兰*

(深圳市中山泌尿外科医院生殖中心，深圳 518043)

目的研究子宫内膜自然杀伤细胞(uNK)在反复种植失败(RIF)患者与复发性流产(RM)患者分泌期子宫内膜的表达情况。方法选取2013年3月至2016年10月于本院生殖医学助孕中心的RIF患者(20例)和RM患者(35例)，对照25例。于患者尿LH试纸检测峰值出现后第7～9天，利用子宫内膜取样器刮取少量子宫腔内膜组织；根据子宫内膜形态学Noyes标准，确定RIF患者组(n=20)、RM患者组(n=35)与对照组(男性因素不孕患者，n=25)子宫内膜分期；以CD56作为uNK的表面标记物，免疫组化技术检测3组患者分泌期子宫内膜CD56阳性细胞的数量，并利用Vectra®自动病理成像定量分析系统计算细胞阳性细胞率。结果3组患者内膜形态学分期均有早、中、晚分泌期病例；RIF组与RM组患者分泌期子宫内膜CD56阳性细胞率[分别为(17.59±12.59)%、(16.54±11.37)%]显著高于对照组[(8.01±7.19)%](P<0.01)；3组患者子宫内膜CD56阳性细胞率从分泌早期到分泌晚期均呈显著递增趋势(P<0.05)；RIF组与RM组分泌早期、中期及晚期CD56阳性细胞率均显著高于对照组(P<0.05)。结论 RIF与RM患者子宫内膜分泌早、中、晚期uNK细胞数量异常升高，提示其可能影响子宫内膜容受性，从而导致妊娠失败。

反复种植失败； 复发性流产； 子宫内膜自然杀伤细胞； CD56

Objective： To investigate the natural killer cells(uNK)levels in endomitrium of secretory phase in the patients with repeated implantation failure(RIF)or recurrent miscarriage(RM).

Methods： Endometrial samples were obtained with an endometrial curette from 7thday to 9thafter the LH surge.Endometrial stage was determined according to the Noyes standard of endometrial morphology.The number of CD56 positive cells in endometrial biopsies was detected by immunohistochemical technique with CD56 as the surface marker of uNK in 25 normal control women whose infertility caused by male factors，20 women with RIF and 35 women with RM.The percentage of CD56+cells were analyzed by Vectra®automatic pathological imaging quantitative analysis system.

Results： According to the Noyes standard of endometrial morphology，the endometrium in early-，mid-，late- secretory phase were confirmed in the patients of three groups.The percentage of uterine CD56+cells in secretory phase in RIF group [(17.59±12.59)%] or RM group [(16.54±11.37)%] was significantly higher than that in the control group[(8.01±7.19)%](P<0.01).The percentage of CD56+cells was gradually increased through the early-，mid- to late- secretory phase in all three groups(P<0.05).The percentage of CD56+cells in women with RM and RIF were significantly higher than that in normal control women in each phase(P<0.05).

Conclusions： The abnormal increase of uNK number in endometrium of early-，mid-，late- secretory phase in patients with RIF and RM may affect the endometrial receptivity，thus lead to pregnancy failure.

Keywords： Repeated implantation failure； Recurrent miscarriage； uNK cells； CD56

(JReprodMed2017，26(10)：1016-1021)

反复种植失败(RIF)和复发性流产(RM)的病因多而且复杂，是生殖医学领域待解决的难题。近年来，随着生殖免疫的发展，人们逐渐认识到免疫因素在RIF和RM发病中的作用，越来越多的免疫机制被揭示，提示免疫因素在胚胎的种植以及妊娠的维持中扮演着重要角色。文献报道，多数反复妊娠失败与母胎界面免疫系统的失衡相关[1-2]。因此，分泌期母胎界面免疫微环境与子宫内膜容受性的研究越来越重要。子宫自然杀伤(uNK)细胞是胚胎植入前子宫内膜和早孕期蜕膜中数量最多的一类免疫细胞，特征表型是CD56+CD16-。uNK细胞随月经周期变化而变化，增殖期较低，而分泌中期其比例迅速上升，并在早孕期达高峰，随着妊娠的进展又逐渐下降，直到分娩后恢复到月经期水平[3-4]。胎儿的滋养层细胞侵入母体蜕膜后与uNK细胞相互作用。正常妊娠状态下，uNK细胞分泌一系列细胞因子和血管生长因子，调控滋养层细胞入侵并参与子宫螺旋动脉的重塑，调节子宫内膜容受性，参与胚胎种植[5-6]；近年来，uNK细胞已经引起了广泛学者的关注，研究表明，其数量与功能的异常可能是反复妊娠失败的重要因素[6-8]。本研究通过免疫组化技术检测RIF、RM患者与正常对照组分泌早、中、晚期uNK阳性细胞率，探讨uNK细胞与反复妊娠失败的关系。

材料与方法

一、研究对象

2013年3月至2016年10月期间于本院生殖医学助孕中心接受治疗的患者作为研究对象。

纳入标准：(1)符合RIF定义(经历3个或3个以上取卵周期，且每个周期均有优质胚胎移植或多次移植的胚胎数量≥10个，仍妊娠失败者)或RM定义(经历连续2次或2次以上的孕20周前自然流产的患者)；(2)月经周期规律(周期26～31 d)；(3)夫妇双方外周血染色体核型正常。

排除标准：(1)女方生殖解剖结构异常；(2)女方基础内分泌异常；(3)女方患自身免疫性疾病；(4)女方凝血功能异常；(5)急性感染期；(6)纳入研究前3个月内曾接受过激素治疗。

并募集同期因男方因素(无精症、少精症、畸精症)所致不孕而进行第一周期IVF-ET且成功分娩活婴的自愿者作为对照组(Ctrl组)。

共纳入80例患者，其中RIF患者20例，RM患者35例，Ctrl组患者25例。所有入选患者均签署了知情同意书，实验流程获得医院学术与伦理学委员会许可。

二、研究方法

1.内膜标本收集：自月经周期第10天起，试纸监测尿LH水平，于LH峰值出现后第7～9天，利用子宫内膜取样器刮取少量子宫腔内膜组织，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗去除组织表面血污，于10%中性福尔马林固定液中固定4～6 h。组织常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡及包埋。

2.免疫组化检测方法及结果判定：包埋子宫内膜组织作4 μm厚度切片，常规脱蜡，3%过氧化氢15 min封闭内源性过氧化物酶，5%胎牛血清封闭20 min阻断非特异性染色。EDTA抗原修复液微波加热处理后，鼠抗人CD56(Dako Cytomation，丹麦)抗体工作液37 ℃孵育1 h。以PBS代替一抗作为阴性对照，扁桃体作为阳性对照。滴加兔、鼠通用二抗(Dako Cytomation，丹麦)，37 ℃孵育30 min。滴加 DAB工作液(Dako Cytomation，丹麦)显色，待显色至棕黄色时终止。苏木素复染，氨水返蓝，梯度酒精脱水，树胶封片。

Vectra®自动病理成像定量分析系统(Perkin Elmer，美国)定量分析CD56阳性细胞率，操作流程参考文献[9]所述。纳入被组织覆盖面积超过80%的图像，阳性细胞率定义为DAB阳性细胞数/子宫内膜总细胞数×100%。

3.性激素水平测定：月经第2～3天收集患者外周血，采用罗氏电化学发光仪(Cobas e601，Roche，瑞士)检测血清FSH、E2、孕酮(P)及LH水平，所用配套试剂盒均购于瑞士Roche公司。

4.子宫内膜形态学分期：常规苏木素-伊红(HE)染色，根据Noyes标准，光镜显微镜下确定子宫内膜分期。

三、统计学分析

应用SPSS 21.0软件进行统计分析。正态分布资料以均数±标准差表示，非正态分布数据以中位数(四分位数)表示。正态分布数据比较采用t检验，非正态分布资料比较采用Mann-Whitney U检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者一般资料

本项研究共纳入80例研究对象，其中RIF组20例，RM组35例，Ctrl组25例。患者年龄27～40岁，平均(32.63±2.60)岁。3组患者间年龄、体重指数(BMI)、基础激素值(FSH、E2、P、LH)圴无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 3组患者一般资料比较(-±s)

注：△资料呈非正态分布，表达为中位数(下四分位数-上四分位数)[M(QL-QU)]

二、子宫内膜HE染色分期结果

根据Noyes子宫内膜形态学分期标准，分泌期早期子宫内膜腺体管腔扩张、出现明显核空泡，间质局部水肿；分泌期中期，腺体更扩张、腺上皮细胞呈明显的顶部分泌大泡，但没有核下空泡，间质水肿明显，间质细胞呈裸核状，螺旋小动脉明显可见；分泌期晚期腺体呈明显“锯齿”状，腺体细胞胞浆肿胀，突入管腔，间质从致密到松散，“小动脉珠”可见(图1)。本研究纳入的三组患者中，分期情况分别是：RIF组患者(早期6例、中期8例、晚期6例)，RM组患者(早期9例、中期17例、晚期9例)，Ctrl组患者(早期7例、中期14例、晚期4例)。

三、各组患者分泌期子宫内膜CD56阳性细胞率比较

CD56阳性信号分布在子宫内膜间质中，集中分布在血管和腺体周围，以胞膜或胞质着色(图2)。分泌期(包括早、中、晚期)Ctrl组uNK阳性细胞率(8.01±7.19)%，显著低于RIF组[(17.59±12.59)%]及RM组[(16.54±11.37)%](P<0.01)。

A：分泌早期；B：分泌中期；C：分泌晚期图1 子宫内膜HE染色分期情况 HE染色 ×200

各图中右上角图像为相应区域的放大图(×400)图2 CD56阳性细胞在3组患者分泌期子宫内膜中的定位及分布 免疫组化染色 ×200

四、各组患者分泌期各期子宫内膜CD56阳性细胞率比较

本研究进一步将RIF/RM组与Ctrl组患者分泌早、中、晚期子宫内膜CD56阳性细胞率分别进行了比较。结果显示，RM组分泌早期CD56阳性细胞率均显著高于Ctrl组(P<0.05)，而RIF组较对照组有增高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；RIF组与RM组分泌中、晚期CD56阳性细胞率均显著高于Ctrl组(P<0.05)(表2，图3)

另外，本项研究还对各组组内分泌各期子宫内膜CD56阳性细胞率进行了比较。结果表明，3组患者子宫内膜CD56阳性细胞率从分泌早期到分泌晚期均呈递增趋势，并具有显著差异性(P<0.05)(表2、图4)。

早、中、晚分别示分泌早期、中期和晚期；相互比较，*P<0.05图3 3组患者分泌各期CD56阳性细胞率组间比较

表2 3组患者分泌早、中、晚期子宫内膜CD56阳性细胞率(%)

注：与同期Ctrl组比较，*P<0.05；组内各期之间比较，#P<0.05

早、中、晚分别示分泌早期、中期和晚期；相互比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001图4 3组患者分泌各期CD56阳性细胞率组内比较

讨 论

在正常规律的月经周期中，排卵后6～8 d，即LH峰出现后7～9 d黄体发育达到高峰期，因此一般将LH+7～9 d判断为分泌中期。然而，子宫内膜的形态是否真正发育到分泌中期，仍需进一步通过组织学染色进行确认。本研究中，3组人群均在LH+7～9 d在本中心进行子宫内膜活检，然后通过HE染色鉴别和分析子宫内膜的形态。结果显示仅有部分患者子宫内膜处于分泌中期，其中RIF组患者处于分泌早期6例、中期8例、晚期6例；RM组患者处于分泌早期9例、中期17例、晚期9例；Ctrl组患者处于分泌早期7例、中期14例、晚期4例。这一数据提示通过LH+7～9 d判别子宫内膜处于分泌中期，存在偏差。推测可能与个体体内激素水平、子宫内膜相关受体数量及排卵时间不同有关。因此，对于黄体分期的判断，应结合子宫内膜的形态学情况加以分析。

胎儿是携带父方基因的同种异体抗原组织，在正常妊娠中，却没有受到母体免疫系统攻击而存活并直至分娩，这一过程与母胎界面的免疫微环境平衡息息相关。子宫内膜作为胚胎植入与生长的土壤，和外周血一样，存在着各种不同的免疫细胞群，其数量及功能有着周期性的变化。uNK细胞是胚胎植入前内膜和早孕期蜕膜中数量最多的一类免疫细胞[10]，其不受人类白细胞抗原(HLA)的限制，就能对抗原进行识别，即能杀灭一些肿瘤细胞和感染细胞。uNK细胞分泌各种细胞因子和血管生成因子，如：粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、集落刺激因子(CSF-1)、白细胞抑制因子(LIF)、转化生长因子(TGF-β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN-γ)、血管内皮生长因子(VEGF)等，对内膜血管生成和胚胎植入起积极作用，对子宫内膜容受性发挥免疫调节作用，其数量和功能的失衡可能引起胚胎着床失败和流产[11-12]。

在正常月经周期中，增生期uNK细胞占子宫内膜淋巴细胞的比例较低，到分泌中期迅速增加；而在妊娠状态下，uNK数量在孕早期达到峰值，随后开始下降。在本研究人群中，育龄女性分泌期uNK占内膜总细胞的8%左右，而妊娠失败患者(包括RIF和RM)uNK所占比例较高，约为17%左右；进一步对分泌早、中、晚期uNK的数量进行分析，发现RM组分泌早期uNK数量显著高于Ctrl组；RIF组、RM组分泌中、晚期uNK的数量均显著高于Ctrl组，即RIF、RM患者uNK细胞在分泌早、中、晚期的各阶段均表达异常，与已发表文献数据一致[13-14]。Clifford等[13]的研究表明，反复早期妊娠丢失患者uNK细胞水平明显高于正常对照；Tuckerman等[14]研究了RIF患者LH+7～9 d子宫内膜CD56+、CD16+和CD69+细胞的水平，结果表明，RIF患者CD56+细胞水平显著高于对照组，而CD16+和CD69+细胞没有显著差异。这些研究和我们的数据均提示，RIF和RM患者子宫内膜uNK数量比例发生失调，其可能打破了子宫内膜免疫微环境的平衡，影响子宫内膜容受性，从而导致了反复妊娠失败的发生。

妊娠期间，uNK细胞的主要功能是参与子宫螺旋动脉的重新构建，并通过调节滋养层细胞侵入生长而促使胎盘形成[15]。研究发现，在妊娠早期，胎儿绒毛外滋养层细胞(EVT)和uNK细胞的相互作用有助于蜕膜动脉血管的重塑，以保证为胎儿提供足够的血容量[16-17]。胎儿滋养层细胞可分泌可溶性的HLA-G(sG)，sG通过与uNK的受体KIR2DL4识别后经内吞作用而被内体吞噬，从而引起持续性的促炎和促血管生成反应，进一步促使血管重构[18]。同时，由于uNK细胞能够与胎儿滋养层细胞直接作用，一旦子宫内局部环境改变或者发生炎症反应，uNK细胞的比例将会失调，此时uNK可能从保护性作用转化为毒性杀伤作用，亦可能成为致使胚胎遭受攻击的主要因素；而过高的uNK可使内膜血管形成增多，过早过快形成母胎循环，胚胎植入时形成了过量的氧化应激，或影响子宫内膜细胞因子的平衡，最终导致着床失败。既往研究证实了妊娠失败患者子宫内膜有较高uNK数量，提示在临床上可对uNK细胞数量过高的患者进行免疫干预。文献报道，强的松龙治疗能下调RIF患者uNK细胞的水平，并显著提高成功率[19]。我们中心的数据也表明，对uNK细胞数量过高的患者进行干预，uNK细胞数量降低后，妊娠成功率明显提高(未公开发表)。

综上所述，uNK细胞是分泌期和早孕期较多的一类免疫细胞，分泌多种细胞因子和血管生长因子，调控着内膜螺旋动脉的重塑和滋养层细胞的侵入。我们的数据显示了分泌早、中、晚期RIF和RM患者uNK细胞数量发生异常。但是，uNK细胞除了主要特征表型CD56brightCD16-外，还存在其它表型，如CD56dimCD16+[20]，其在功能及基因表达上与CD56brightCD16-型uNK细胞存在很大的不同。CD56dimCD16+型uNK细胞通过释放胞内杀伤性物质(穿孔素、颗粒酶等)，来发挥细胞毒性杀伤作用，或通过抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)来杀伤目标细胞[21]；而本研究中采用的是免疫组化单染技术，只分析了子宫内膜CD56+型uNK细胞，并未阐明各种类型uNK细胞数量、功能与妊娠的关系。另外，本项研究纳入的样本量较少，因此，拟在后续研究中，在加大样本量的同时，采用流式细胞术对uNK细胞表型进一步分类及胞内杀伤性物质(如穿孔素、颗粒酶等)进行检测，分析uNK细胞在妊娠期以及生殖失败患者中的功能及其可能的作用机制。

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[编辑：罗宏志]

Quantitativeanalysisofnaturalkillercellsinendometriumofsecretoryphaseinwomenwithrepeatedimplantationfailureorrecurrentmiscarriage

CHENCong，HUANGChun-yu，LIYu-ye，YUShu-yi，CHENWei-hong，LINSheng-lai，DUChen-yang，MOMei-lan*

ReproductiveCenterofShenzhenZhongshanUrologicalHospital，Shenzhen518043

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.10.012

2017-04-02；

2017-05-30

深圳市科创委基础研究项目(JCYJ20150402165325178)，中华医学会临床医学科研专项资金-生殖医学青年医师研究与发展项目(16020200636)

陈聪，男，广东茂名人，本科，检验技师(初)，医学检验专业.(*

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