王忠忠， 龚国利,2

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.西安市微生物药物工程实验室， 陕西 西安 710021)

短短芽孢杆菌M01产抗菌物质工艺条件优化及其主要抑菌成分探究

王忠忠1， 龚国利1,2

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.西安市微生物药物工程实验室， 陕西 西安 710021)

采用选育的短短芽孢杆菌株M01进行抗菌活性物质发酵工艺及其主要抑菌成分的研究.通过单因素和正交试验，优化得出一条发酵生产抗菌物质的最佳工艺，其工艺条件分别为初始pH6.0，接种量8%，发酵温度28 ℃，发酵周期48 h，优化后生产的抗菌物质的抑菌活性比优化前提高了38.7%.此外，经80%的冷乙醇提取抗菌物质，对其进行透析脱盐，Sephadex-50凝胶过柱初步分离纯化，SDS-PAGE分析发现分子量为62.0 kD、 40.0 kD、 29.0 kD、20.1 kD的蛋白可能是菌株M01抑菌活性物质的主要成分，其中29.0 kD左右的蛋白可能是菌株M01抑菌活性物质的重要成分.

短短芽孢杆菌M01； 抑菌活性； 正交优化； 主要抑菌成分

Abstract:A new strain ofBrevibacillusbrevisM01 was carried out to reserach the main components of the active antibacterial substance and optimize its fermentation conditions.The optimum conditions to produce the antimicrobial substances were as follows:Initial pH6.0,inoculation amount 8%,fermentation temperature 28 ℃ and fermentation cycle 48 h by single factor and orthogonal experiment,after optimization,the activity of antibacterial substances was 38.7% higher than before.In addition,the 80% of cold ethanol was used to extract the antimicrobial substance that was desalted and purified by Sephadex-50 gel column,and SDS-PAGE analysis showed that the protein with molecular weight of 62.0 kD,40.0 kD,29.0 kD and 20.1 kD could be the main component of the antimicrobial active substance of strain M01,and the protein of about 29.0 kD may play an important role in it.

Keywords:BrevibacillusbrevisM01; antimicrobial activity; orthogonal optimization; main antibacterial ingredients

0 引言

短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)于1996年根据遗传信息的差异性从短芽孢杆菌属中划分以来，现已确定的有二十多种，其中大多数菌种都具有重要的生物学意义.

据报道，短短芽孢杆菌(B.brevis)能够分泌短杆菌肽(gramieidin)、短杆菌酪肽(tyrocidine)、胞外多糖[1]、几丁质酶[2]以及羟苯乙酯[3]等多种抗菌物质抑制病原菌的生长[4,5].例如，Murray T等[6]探究发现的十肽抗生素，短杆菌肽S已被证明具有高效的杀菌能力. Li S等[2]报道的短短芽孢杆菌产生的高稳定性的几丁质酶在蔬菜霉菌病的防治中已表现出显著的抗菌效果.Wafaa M等[7]报道的短短芽孢杆菌产生的抗菌活性物质能够成功抑制番茄和生菜体内外的灰霉病.Bapat S等[8]报道的短短芽孢杆菌有可能作为一种生防试剂治愈豌豆和黄瓜农作物的镰刀菌枯萎病.同时，短短芽孢杆菌产生的胞外拮抗物质能够诱导霉菌病原体的肿胀，导致其细胞破裂而死亡[9].并且该菌能以活体形式寄居到大量的真菌植物病原体中,有效的抑制病原体的生长[10,11]，因此在农业生物防治上具有广阔的应用前景.

在这项研究中，采用的菌株短短芽孢杆菌M01是由本课题组实验室分离保存，其产生的抗菌物质对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，黑曲霉等细菌和真菌都具有良好的抗性.因此对该菌产抗菌物质工艺条件的探究具有重要的工业化生产意义，此外，对抗菌活性物质主要成分进行了初步的分析，发现蛋白类物质是该抗菌物质的主要抑菌成分，但具体是哪种蛋白成分还需进一步的确定.

1 材料与方法

1.1 主要原料与试剂

(1)供试菌株：短短芽孢杆菌M01，指示菌：金黄色葡萄球菌CVCC1885.

(2)NA：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂1.5%，pH 7.2.

(3)发酵培养基：豆饼粉1.5%，蛋白胨2.0%，氯化钙0.20%，Tween-20 1%，pH 7.2.指示细菌培养基NA.

(4)试剂：Sephadex-50、大孔树脂XAD-16、过硫酸铵、30%丙烯酰胺溶液、 蛋白marker均购自上海生工生物工程有限公司.

1.2 菌株M01生长曲线的测定

取菌株M01菌悬液0.5 mL加入含50 mL的发酵培养基中，轻微振荡，使菌体分布均匀，将接种后的培养基置于摇床上，37 ℃，220 r/min培养0、4、6、8、10、12、14、16、22、30、38、44、50 h，分别依次取样，4 ℃保存，待全部完成培养后在波长600 nm下进行比浊测定.以未接种的液态发酵培养基作对照，记录光密度值OD600，以培养时间为横坐标，光密度值OD600为纵坐标，绘制菌株M01的生长曲线.

1.3 不同工艺条件对菌株M01产抗菌活性物质的影响

1.3.1 初始pH对菌株M01抑菌活性的影响

以4%(V/V)的接种量接种菌株M01菌悬液至60 mL(300 mL摇瓶，下同)的发酵培养基中，将发酵培养基初始pH值分别调为3、4、5、6、7、8、9、10、11，28 ℃，180 r/min摇瓶培养48 h，取其离心上清液用0.45μm细菌过滤器过滤，吸取滤液230μL，采用琼脂打孔扩散法分别进行不同初始pH值对菌株M01抑菌活性影响的测定，以空白发酵培养基作对照(CK)，每组试验重复三次.

1.3.2 温度对菌株M01抑菌活性的影响

以4%(V/V)的接种量接种菌株M01菌悬液至60 mL的发酵培养基中，分别以24、26、28、30、32、34、37、40、45 ℃的温度条件，180 r/min摇瓶培养48 h，取其离心上清液用0.45μm细菌过滤器过滤，吸取滤液230μL，采用琼脂打孔扩散法分别进行不同温度对菌株M01抑菌活性影响的测定，以空白发酵培养基作对照(CK)，每组试验重复三次.

1.3.3 发酵周期对菌株M01抑菌活性的影响

以4%(V/V)的接种量接种菌株M01菌悬液至60 mL的发酵培养基中，28 ℃，180 r/min摇瓶培养8、16、24、36、48、60、72、84 h，取其离心上清液用0.45μm细菌过滤器过滤，吸取滤液230μL，采用琼脂打孔扩散法分别进行不同发酵时间对菌株M01抑菌活性影响的测定，以空白发酵培养基作对照(CK)，每组试验重复三次.

1.3.4 接种量对菌株M01抑菌活性的影响

分别以2%～14%的接种量接种菌株M01菌悬液至60 mL的发酵培养基中，28 ℃，180 r/min摇瓶培养48 h，取其离心上清液用0.45μm细菌过滤器过滤，吸取滤液230μL，采用琼脂打孔扩散法分别进行不同接种量对菌株M01抑菌活性影响的测定，以空白发酵培养基作对照(CK)，每组试验重复三次.

1.4 菌株M01抗菌活性物质的提取方法选择及提取

1.4.1 菌株M01发酵离心上清液活性物质萃取

以4%(V/V)的接种量接种菌株M01菌悬液至60 mL的发酵培养基中，28 ℃，180 r/min摇瓶发酵48 h，11 000 r/min离心10 min，取其离心上清液用0.45μm细菌过滤器过滤，吸取滤液150 mL，分别加入等体积的正丁醇、氯仿、乙酸乙酯、二甲基亚砜、石油醚等有机溶剂过夜萃取，将有机相与水相分离，水相溶液经0.45μm滤膜过滤，有机相浓缩至5 mL.采用琼脂打孔扩散法分别测定水相和有机相溶液的抑菌活性，以空白有机溶剂作对照.

1.4.2 大孔树脂XAD-16吸附法提取菌株M01活性抗菌物质

500 mL的发酵离心上清液加入25 g大孔树脂XAD-16，室温条件下，140 r/min振荡6h，将大孔树脂与上清液分离，向含有吸附物的大孔树脂中加入4倍体积的丙酮溶液进行2 h解吸，采用琼脂打孔扩散法分别测定丙酮解析液和XAD-16吸附过滤后的上清液抑菌活性，以空白丙酮溶液作对照.

1.4.3 硫酸铵分段盐析法提取菌株M01主要抗菌活性物质

菌株M01发酵离心上清液中缓慢加入固体硫酸铵粉末，使其终浓度分别达到30%、40%、50%、60%、70%、80%，于4 ℃静止过夜，11 000 r/min离心15 min，分别收集上清及沉淀，将沉淀溶于25 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，采用琼脂打孔扩散法分别测定上清及沉淀的抑菌活性，以终浓度为80%的硫酸铵对空白发酵培养基作相同的处理，其沉淀溶于25 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中作对照.

1.4.4 低温乙醇沉淀法提取菌株M01主要抗菌活性物质

菌株M01发酵离心上清液中缓慢加入冰冷无水乙醇，使其终浓度分别达到30%、40%、50%、60%、70%、80%，于4 ℃静止过夜.11 000 r/min离心15 min，分别收集上清及沉淀，将沉淀溶于25 mmol/L PBS缓冲液中，以终浓度为80%的冷乙醇对空白发酵培养基作相同的处理，其沉淀溶于25 mmol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)中作对照.采用琼脂打孔扩散法分别测定上清及沉淀的抑菌活性.

1.5 菌株M01胞外抗菌粗提物初步纯化

经80%冰冷无水乙醇沉淀下来的抗菌活性物质溶解于25 mmol/L PBS缓冲液中，置于分子量为8～14 kDa的透析袋中透析脱盐，以5%的柱床体积上样量进行Sephadex-50过柱纯化，流速0.4 mL/min，每管8 mL收集洗脱液(缓冲液35 mmol/L Tris-HCl)，将收集管内的洗脱液置于透析袋内，PEG20000包埋浓缩30 min，采用琼脂打孔扩散法测定各收集管洗脱液抑菌活性.

1.6 SDS-PAGE分析

取具有抑菌活性组分的各收集管的浓缩液16μL至200μL的Ep管中，加入4μL蛋白上样缓冲液，混匀，沸水浴煮沸10 min使其充分变性，加样开始电泳分析.SDS-PAGE电泳条件：配胶：5%的浓缩胶，15%的分离胶，电压：浓缩恒压90 V，分离恒压160 V.

2 结果与讨论

2.1 菌株M01生长曲线

菌株M01生长曲线如图1所示.由图1可以看出，菌株M01的指数生长期处于4～18 h，18 h后是该菌的生长稳定期，根据此生长曲线进行试验，发现菌株M01在生长过程中抗菌物质活性变化趋势如图2所示.由图2可知，菌株M01在指数生长后期就开始产抗菌物质，生长稳定后期抗菌物质的抑菌活性达到最大.这一发现可为菌株种子液的制备以及发酵周期的选定提供理论参考，提高抗菌物质的产量及生产效率.

图1 菌株M01生长曲线

图2 菌株M01生长过程抗菌物质 活性变化趋势

2.2 不同工艺条件对菌株M01发酵生产抗菌物质的影响

2.2.1 抗菌物质生产周期的确定

发酵时间对菌株M01产生的抗菌物质的抑菌活性影响如图3所示.由图3可知，菌株M01在发酵开始后的前48 h，该抗菌物质的抑菌活性随着时间的增加而提高，发酵开始后的48～84 h，该抗菌物质的抑菌活性随着时间的增加而下降，因此生产该抗菌物质的最适发酵时间是48 h，此时抗菌物质的抑菌活性最高，其抑菌直径达15.6 mm.

图3 发酵时间对抗菌物质活性影响

2.2.2 发酵温度对菌株M01发酵生产抗菌物质的影响

发酵温度对菌株M01产生抗菌物质的抑菌活性大小有着重要的影响，不同的温度条件下产生的抗菌物质的抑菌活性有所差异，温度对菌株M01产生的抗菌物质抑菌活性大小的影响趋势如图4 所示.由图4可知，在研究的温度变化范围内，当发酵温度处于28 ℃时，菌株M01产生的抗菌物质的抑菌活性最好，其抑菌直径达15.87 mm，总体的变化趋势是随着温度的增加，抗菌物质的抑菌活性先增大后减小.

图4 温度对抗菌物质活性影响

2.2.3 初始pH对菌株M01抑菌活性的影响

培养基初始pH对菌株M01产生抗菌物质的抑菌活性影响如图5所示.由图5可知，将发酵培养基初始pH分别调为3、4、5后，发酵液中无抑菌活性物质产生，这可能是该菌体自身对酸较敏感，超高了其耐受范围，限制了菌体的生长，从而影响了菌株M01分泌活性抗菌物质.还可能是发酵液中一定酸度的存在，改变了菌株M01代谢调控通路，使该菌不能产生抗菌活性物质.当培养基初始pH分别调为6～11后，发酵液中有明显的抑菌活性物质产生，且pH调为7时，菌株M01产生的抗菌物质抑菌活性最高.从图5进一步可以看出，培养基初始pH对菌株M01抗菌物质生产非常重要.

图5 初始pH对抗菌物质活性影响

2.2.4 接种量对菌株M01抑菌活性的影响

接种量对细菌菌株的生长及产物的分泌有着重要的影响，一般来说，接种量越小，细菌生长的迟滞期越长，菌体生长缓慢，发酵周期延长，增加生产成本；接种量过大，发酵底物消耗过快，菌体大量形成，不利于菌体代谢产物的形成.不同接种量对菌株M01产生的抗菌物质抑菌活性的影响如图6所示.由图6可知，当发酵培养基的接种量为6%时，抗菌物质的抑菌活性最好.

图6 接种量对抗菌物质活性影响

2.2.5 发酵工艺参数正交试验优化

以单因素实验结果为正交优化依据，如表1所示选定正交试验的因素水平，并以抗菌物质的抑菌直径为正交优化试验的测定指标进行试验，通过直观的极差分析，得到产抗菌物质的最佳工艺.

表1 发酵工艺参数因素水平

发酵工艺优化正交试验分析结果如表2 所示.由表2可知，短短芽孢杆菌M01产抗菌物质的最佳发酵工艺为A2B1C2D3，即发酵温度为28 ℃，发酵培养基初始pH 6.0，发酵周期48 h，接种量8%，抗菌物质的抑菌直径达27.6 mm.对实验结果进行极差分析可知，RC>RB>RA>RD.

即选取的影响因素对抗菌物质的抑菌活性影响主次顺序为：发酵周期>发酵培养基初始pH>发酵温度>接种量，表明发酵时间对抗菌物质的抑菌活性影响最为明显，发酵培养基初始pH次之，发酵温度第三，接种量影响相对最小.

表2 发酵工艺的正交试验优化

2.2.6 发酵工艺优化前后的抑菌活性

菌株M01发酵工艺优化前后产抗菌物质的抑菌活性大小如图7所示.由图7可知，发酵工艺优化前得到的抗菌物质的抑菌直径为18.6 mm，发酵工艺优化后菌株M01产生的抗菌物质的抑菌直径为25.8 mm，比优化前产生的抗菌物质的抑菌活性提高了38.7%，表明优化后的发酵工艺能够明显的提高抗菌物质的抑菌活性.此外，研究发现优化后的发酵工艺同样适用于发酵罐(15 L)发酵，琼脂打孔扩散法测定发酵罐发酵产生的抗菌物质的抑菌活性可达28.3 mm，因此该工艺的开发对于菌株M01抗菌物质的批量生产具有重要经济效益及社会价值.

1：工艺优化后抗菌物质的抑菌活性；2：工艺优化前抗菌物质的抑菌活性；CK1 ：空白发酵培养基；CK2 ：无菌水图7 菌株M01发酵工艺优化验证

2.3 菌株M01抗菌活性物质的提取

采用正丁醇、氯仿、乙酸乙酯、二甲基亚砜、石油醚过夜萃取菌株M01发酵离心上清液，分别得到有机相和水相，经抑菌活性测定，有机相溶液对指示细菌无抑菌活性，而水相溶液对指示细菌有明显的抑菌活性，且与未经萃取的上清液抑菌活性基本一致.这说明了以上有机试剂均无法达到萃取上清液中抗菌物质的目的.其原因可能是该抗菌活性物质是极性较大的化合物.以大孔树脂XAD-16对上清液中的抗菌物质进行提取，发现经大孔树脂XAD-16吸附后，只有部分抗菌物质能够被提取出来，因此大孔树脂XAD-16吸附提取法无法达到完全提取抗菌物质的目的.试用硫酸铵分段盐析法提取菌株M01代谢产生的主要抗菌活性物质，试验结果发现硫酸铵分段盐析法也无法将上清液中的抗菌物质提取出来.

试用低温乙醇沉淀法对菌株M01发酵离心上清液中的主要抗菌活性物质进行提取，等体积的上清液缓加入不同饱和度的冰冷无水乙醇，4 ℃冰箱静止过夜，离心分离，分别测定不同饱和度的沉淀及上清液的抑菌活性，实验结果如图8所示.

图8 不同乙醇浓度对抗菌物质的提取

由图8可知，随着冰冷无水乙醇饱和度的增加，处理后的沉淀的抑菌活性不断增强，至80%饱和度处理后，沉淀对指示菌的抑菌活性达到最强，但处理后的上清液中的抑菌活性随着冰冷无水乙醇饱和度的增加而下降，至80%饱和度处理后，上清夜中的抑菌活性完全消失，表明该法能够将上清液中主要抗菌物质完全提取出来，且以80%乙醇为最适乙醇沉淀浓度.

2.4 菌株M01主要抑菌活性成分初步分析

在本研究中，菌株M01的主要抑菌活性物质不能被有机溶剂萃取，也不能被硫酸铵沉淀，但可以被终浓度为80%的冷乙醇沉淀，与短短芽孢杆菌HAB-5[12]、FM4B[13]和JK2[1]等报道的结果类似.将经80%乙醇沉淀下来的抗菌活性物质溶解于25 mmol/L PBS缓冲液中，置于透析袋内，24 h透析脱盐，经Sephadex-50凝胶层析，收集58管洗脱液，每管8 mL,将其二倍稀释在280 nm条件下测定各管的吸光值，其结果如图9所示.

由图9可知，在收集的4～18管洗脱液中，随着收集管数的增加，洗脱液的吸光值呈现先增大后减小的变化趋势，表明各管洗脱液中蛋白类物质的浓度同样先增大后减小，且在第9管其浓度达到最大.吸取各收集管中溶液200μL进行抑菌活性测定发现5～16管具有抑菌活性，其抑菌活性的大小与收集管内蛋白类物质的浓度成正比.其余各收集管洗脱液均无抑菌活性.采用PEG20000对其余各收集管洗脱液进行30 min的透析浓缩，琼脂打孔扩散法测定抑菌活性发现4、17、18收集管也有抑菌活性，由此可初步分析发酵上清液中的主要抗菌活性成分是蛋白类物质.

图9 不同收集管洗脱液的吸光值测定

2.5 SDS-PAGE分析

经葡聚糖凝胶初步纯化后具有抑菌活性的洗脱液跑SDS-PAGE凝胶电泳如图10所示.由图10可知，不同的收集管中蛋白质的分子量各不相同，同时也可以进一步看出，蛋白质浓度的大小与各收集管中蛋白质的种类与大小密切相关，通过抑菌活性测定发现9号收集管中的抗菌物质抑菌活性最好，15号管中的抗菌物质也具有良好的抗指示菌活性，但相对其余收集管抑菌活性较弱，由此可以初步说明分子量为62.0 kDa、40.0 kDa、29.0 kDa、20.1 kDa的蛋白都可能是菌株M01抑菌活性物质的主要成分，其中29.0 kDa左右的蛋白可能是菌株M01抑菌活性物质的重要成分.这与报道的HAB-5[12]的主要抑菌物质可能是分子量为60.0 kDa、59.0 kDa、43.5 kDa、和14.4 kDa大小的肽类物质，其中14.4 kDa更可能是HAB-5主要抑菌物质的分子量的研究结果极为相似.

图10 菌株M01抑菌活性物质 的聚丙烯酰胺凝胶电泳

3 结论

本研究对生防菌短短芽孢杆菌M01产生抗菌物质的工艺条件进行优化，并得到了产抗菌活性物质的最佳发酵工艺条件：初始pH6.0，接种量8%，发酵温度28 ℃，发酵周期48 h， 在该工艺条件下，菌株M01产生的抗菌物质对金黄色葡萄球菌CVCC1885抑菌活性比优化前提高了38.7%，采用80%乙醇沉淀法提取抗菌活性物质，得抗菌活性粗提物，对其进行透析脱盐，过Sephadex-50凝胶层析柱初步分离纯化，SDS-PAGE分析发现分子量为29.0 KD左右的蛋白可能是菌株M01抑菌活性物质的重要成分.具体哪一种分子量的蛋白是抗菌物质的主要成分还需进一步的纯化做质谱分析.

[1] 郝晓娟,刘 波,谢关林,等.短短芽孢杆菌JK-2菌株抑菌物质特的研究[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),2007,33(5):484-489.

[2] Li S,Zhao Z A,Li M,et al.Purification and characterization of a novel chitinase fromBacillusbrevis[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2011,38(4):557-563.

[3] Jianmei C,Bo L,Zheng C,et al.Identification of ethylparaben as the antimicrobial substance produced byBrevibacillusbrevisFJAT-08 09-GLX[J].Microbiological Research,2015,172(3):48-56.

[4] 车建美.短短芽胞杆菌(Brevibacillusbrevis)对龙眼保鲜机理的研究[D].福建：福建农林大学,2011.

[5] 薛东红.短短芽孢杆菌XDH的鉴定及其抗菌物质的分离、纯化与部分性质研究[D].泰安：山东农业大学,2006.

[6] Murray T,Leighton F C,Seddon B.Inhibition of fungal spore germination by gramicidin S and its potential use as a biocontrol against fungal plant pathogens[J].Letters in Applied Microbiology,2010,3(1):5-7.

[7] Wafaa M.Haggag.Isolation of bioactive antibiotic peptides fromBacillusbrevisandBacilluspolymyxa against botrytis grey mould in strawberry[J].Archives of Phytopathology & Plant Protection,2008,41(7):477-491.

[8] Bapat S,Shah A K.Biological control of fusarial wilt of pigeon pea byBacillusbrevis[J].Canadian Journal of Microbiology,2000,46(2):125-129.

[9] Sunita C,Allan E J,Steve W.Biological control of fusarium oxysporum,f.sp.lycopersici,on tomato by brevibacillus brevis[J].Journal of Phytopathology,2010,158(8):470-478.

[10] Edwards S G,Seddon B.Mode of antagonism ofBrevibacillusbrevisagainst botrytis cinerea in vitro[J].Journal of Applied Microbiology,2001,91(4):652-659.

[11] Kang S C,Park S,Lee D G.Purification and characteriza-tion of a novel chitinase from the entomopathogenic fungus,metarhizium anisopliae[J].Journal of Invertebrate Pathology,1999,73(3):276-281.

[12] 杨廷雅,孙 亮,周婷婷,等.短短芽孢杆菌BrevibacillusbrevsHAB-5主要抑菌活性成分的分析及其特性研究[J].中国生物防治学报,2014,30(2):222-231.

[13] 胡雪芹,芮广虎,周雪梅,等.生防菌FM4B的鉴定及抗菌物质的性质研究[J].上海交通大学学报(农业科学版),2011,29(1):75-80.

【责任编辑：陈佳】

OptimizationoftechnologicalconditionsforproductionantibacterialsubstancesfromBrevibacillusbrevisM01andinvestigationofthemainantibacterialcomponents

WANG Zhong-zhong1， GONG Guo-li1,2

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China； 2.Xi′an Microbiology and Pharmaceutical Engineering Laboratory, Xi′an 710021, China)

2017-06-21

陕西省教育厅自然科学专项科研计划项目(14JK1101)； 西安市未央区科技计划项目(201309)

王忠忠(1992-)，男，宁夏平罗人，在读硕士研究生，研究方向：微生物发酵

2096-398X(2017)05-0145-06

Q939.92

A