王玲娜，孙希芳，张芳，张永清

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东医药技师学院，山东 泰安 271016)

金银花贮藏过程中的美拉德反应

王玲娜1，孙希芳2，张芳1，张永清1

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东医药技师学院，山东 泰安 271016)

为了探索金银花贮藏过程中的变色机理，为合理贮藏提供理论依据，在45、55、65、75℃条件下进行加速货架测试试验，用色差仪测定金银花贮藏过程中的颜色参数，紫外可见分光光度计测定游离氨基酸、还原糖等成分含量，HPLC法测定5-羟甲基糠醛(5-HMF)含量，并对所得数据进行统计分析。结果表明，随贮藏时间延长和温度升高，金银花暗度值和色差值增加，褐变指数增大，提示金银花在贮藏过程中发生褐变生成了有色物质；金银花提取液A420nm值稳定上升，说明褐变生成的有色物质为类黑素；氨基酸和还原糖含量随贮藏时间延长逐渐降低，且水提液pH值在贮藏过程中显著下降，说明氨基酸和还原糖可能为褐变的初始反应物；5-HMF不断积累，且温度每升高10℃，褐变反应加快3～5倍，说明5-HMF可能为褐变反应的中间产物，5-HMF生成量和褐变速度密切相关。金银花贮藏过程中颜色参数、氨基酸、还原糖、pH值、A420nm值及5-HMF的动态变化，说明发生了美拉德反应，这是发生褐变的机理之一。

金银花；贮藏；褐变；美拉德反应

AbstractTo explore the color-changing mechanism ofLoniceraejaponicaeFlos during storage and provide theoretical bases for its reasonable storage, the mechanism of maillard reaction was studied with colorimeter measuring the color changes, UV-Vis detecting the contents of amino acid and reducing sugar, high performance liquid chromatography (HPLC) determining the content of 5-HMF during storage under the condition of 45, 55, 65, 75℃ by accelerated shelf life testing (ASLT) method, and the obtained data were analyzed. The results showed that the dark degree value, color difference value and the browning index ofLonicereajaponicaeFlos increased with the storage time prolonging and the temperature rising, which showed that browning reaction occurred in the process of storage and non-ferrous material was produced. The A420nmvalue ofLonicereajaponicaeFlos extracts rose stably, which showed that the non-ferrous material was class melanin. With the storage time extension, the contents of amino acid and reducing sugar reduced, and the pH value of aqueous solution decreased significantly, which showed that amino acid and reducing sugar might be the initial reactants ofLonicereajaponicaeFlos during browning reaction. The content of 5-HMF was gradually accumulated, and the browning reaction sped up 3～5 times with every increase of 10℃. It showed that 5-HMF might be the intermediate product of browning reaction, and the generation of 5-HMF and browning rate was closely related. We could confirm that maillard reaction happened in the process of storage ofLonicereajaponicaeFlos through dynamic changes of the color parameters, the contents of amino acid and reducing sugar, pH value, A420nmand 5-HMF, which was the mechanism of browning reaction.

KeywordsLoniceraejaponicaeFlos; Storage; Browning reaction; Maillard reaction

金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初开的花，具有清热解毒、疏散风热的功效[1]，为常用大宗中药材之一。国家医药管理局和卫生部对其商品质量制定了四级标准，其中外观色泽是判断金银花商品等级的主要指标之一[2]。在干燥加工及贮藏过程中，因受各种不良因素影响，金银花往往发生褐变，导致药材品质下降[3]。引起褐变的因素很多，包括酶促褐变、非酶褐变等。目前，人们关注较多的是酶促褐变[4，5]，而对金银花的非酶褐变知之甚少。非酶褐变是指由各种非酶原因引起的化学反应而造成的褐变，根据反应机制分为抗坏血酸反应、焦糖化反应和美拉德反应。干燥金银花抗坏血酸含量很低，焦糖化褐变温度要达100℃以上，因此推断金银花贮存过程中的非酶褐变可能源自美拉德反应，但尚未得到验证。

美拉德反应是奶粉、脱水蔬菜、果脯变质的重要原因，广泛发生在食品、药品贮藏过程中[6]，其经典反应途径是还原糖与胺反应，该反应可引起初始反应物pH值变化[7]，生成的5-羟甲基糠醛(5-HMF)经进一步缩合、聚合形成复杂高分子色素而发生褐变。生成的色素主要为类黑素类物质，该类物质在420 nm波长下有紫外吸收，可通过测定A420nm值判断所生成的有色物质是否为类黑素[8]。同时，美拉德反应的中间生成物5-HMF的积累与褐变速度密切相关，因此可将金银花贮藏过程中5-HMF的含量变化作为预测褐变速度的重要指标之一[9]。Kroh[10]认为褐变在大于55℃的条件下反应速度较快。因此，本试验在45、55、65、75℃条件下进行货架加速试验，测定金银花在贮藏过程中的颜色参数、pH值、A420nm、氨基酸、还原糖、5-HMF等的变化情况，旨在探索金银花贮藏过程中是否有美拉德反应发生，为合理贮藏提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

金银花药材购自河北省巨鹿县，样品经山东中医药大学张永清教授鉴定，确认为忍冬科植物忍冬LoniceraejaponicaThunb.的干燥花蕾。

试剂：葡萄糖，3,5-二硝基水杨酸，NaOH，酒石酸钾钠，苯酚，亚硫酸钠，亮氨酸，茚三酮，正丁醇，正丙醇，乙二醇，无水乙酸钠，抗坏血酸等。

仪器：Agilent1260 HPLC系统(包括G1311C四元泵、G1329B自动进样器、G1315D二极管阵列检测器、G1316A柱温箱和Agilent Chem Station工作站，美国安捷伦公司)，WF30色差仪(深圳iWAVE公司)，PL203电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，KQ-500DE 型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)，UV-5800型紫外可见分光光度计(上海元析有限公司)，FE20型pH计(梅特勒-托利多上海仪器有限公司)等。

1.2方法

1.2.1 样品处理 将同一批次金银花样品随机分成四份，每份约500 g，分别于45、55、65、75℃(±1.5℃)恒温干燥箱中放置，且于放置0、48、96、168、240、312 h时取样，放凉后以小型粉碎机粉碎，过2 mm孔径筛，置干燥器中备用。

1.2.2 pH值及颜色参数测定 精密称取样品粉末0.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入蒸馏水25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率100 W，频率100 Hz)30 min，放冷，再称定重量，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，离心(4 000 r/min)10 min，取上清液测其pH值及420 nm下的吸光度A。

将金银花样品装在色差仪配套的小黑盒内，铺满盒底，用色差计测量颜色参数a*、b*、L*。测定光源选用内置D65标准光源，窗口直径8 mm，观测角度10°。重复测量10次。用暗度值(100-L*)、与基准值对比的绝对变化值ΔE*和褐变指数BI分析。计算公式如下：

ΔE*=(L*2+Δa*2+Δb*2)1/2；

BI=100(x-0.31)/0.17；

x=(a*+1.75L*)/(5.645L*+a*-3.012b*)。

1.2.3 游离氨基酸含量测定

①溶液配制

茚三酮溶液：称取茚三酮试剂0.6 g，精密加入正丙醇15 mL，搅拌溶解后加入正丁醇30 mL、乙二醇60 mL，最后加入pH值为5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液9 mL，混匀即得。

乙酸-乙酸钠缓冲液(pH值5.4)：称取乙酸钠54.4 g置100 mL无氨蒸馏水中，加热至沸腾，使体积蒸发至60 mL左右。冷却后加冰醋酸调节pH值至5.4即得。

无氨蒸馏水：每1 000 mL普通蒸馏水中加入5%氢氧化钠溶液25 mL，加热煮沸1 h即得。

抗坏血酸溶液：称取50 mg抗坏血酸，用无氨蒸馏水定容至50 mL即得。

氨基酸标准液：称取干燥的亮氨酸对照品0.047 g，用10%异丙醇定容至100 mL，取此溶液5 mL，无氨蒸馏水定容至50 mL，即得5 μg/mL氨基氮标准溶液。

②标准曲线绘制

精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用无氨蒸馏水补足至2 mL，加入3 mL茚三酮溶液，0.1 mL抗坏血酸溶液，沸水浴加热15 min，冷却振摇，加60%乙醇定容至20 mL，混匀后，在570 nm下测定吸光度，以氨基酸浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，经线性回归处理，得回归方程：A=232.57C-0.3406，R2=0.9970。

③样品游离氨基酸含量测定

样品溶液制备：精密称取样品粉末0.1 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入10%乙酸5 mL，超声5 min，再加入25 mL无氨蒸馏水，80℃水浴20 min，过滤即得。

游离氨基酸含量测定：取样品溶液1 mL，准确加入1 mL无氨蒸馏水、3 mL茚三酮溶液、0.1 mL抗坏血酸溶液，100℃水浴加热15 min，取出冷却，振摇，用60%乙醇定容至20 mL，于570 nm处测定吸光度。

1.2.4 还原糖含量测定

①溶液配制

二硝基水杨酸溶液：精密称取3,5-二硝基水杨酸6.3 g，溶于蒸馏水中，加热，依次加入酒石酸钾钠182 g，氢氧化钠21 g，苯酚5 g，亚硫酸钠5 g，搅拌至完全溶解，冷却后用蒸馏水定容至1 000 mL，贮于棕色瓶中备用。

葡萄糖标准溶液：将葡萄糖烘干至恒重，精确称量100 mg，用蒸馏水溶解，并定容至100 mL，配制成1 mg/mL葡萄糖标准溶液。

②标准曲线绘制

精确吸取葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置于25 mL具塞试管中，用蒸馏水补至2 mL，加入二硝基水杨酸溶液1.5 mL，混匀后，沸水浴5 min，取出后立即冷却，再以蒸馏水定容至25 mL，混合均匀。空白调零，在540 nm处测定吸光度。以葡萄糖含量C为横坐标，吸光度A为纵坐标，得回归方程：

C=0.4687A-0.0049，R2=0.9994。

③样品还原糖含量测定

样品溶液制备：精确称取0.1 g样品粉末，置于50 mL具塞锥形瓶中，准确加入25 mL蒸馏水，超声提取30 min，过滤，即得。

还原糖含量测定：准确吸取2 mL样品溶液，加入1.5 mL二硝基水杨酸溶液，沸水浴5 min，取出后立即冷却，用蒸馏水定容至25 mL，540 nm处测定吸光度。

1.2.5 5-HMF含量测定

①溶液配制

5-HMF对照品溶液：精密称定5-HMF对照品适量，用甲醇溶解，配制成浓度为6.96 μg/mL的储备液。

供试品溶液：取样品粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇25 mL，超声提取30 min，取出放冷，补足减失的重量，摇匀，离心，上清液经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

②色谱条件

Agilent ZorBax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～5 min,5% B；5～15 min,5%～10%B；15～25 min,10%B；25～40 min,10%～25%B；40～44 min,25%～35%B；44～45 min,35%～50%B；45～50 min,50%～55% B；50～55 min,55%～100%B；55～60 min,100% B)；流速1.0 mL/min；柱温30℃；进样量20 μL；检测波长284 nm。在此条件下，对照品溶液和供试品溶液色谱图见图1。

A.对照品；B.供试品

图1对照品和供试品284 nm下HPLC色谱图

③方法学考察

对照品溶液和供试品溶液的标准曲线建立：吸取上述对照品溶液2、5、10、20、40 μL，按上述色谱条件进样，测定峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，其峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得标准曲线回归方程：Y=8235.3X-2.0489，R2=0.9999，线性范围为1.392～27.840 μg。

精密度试验：精密吸取对照品溶液10 μL，按上述色谱条件重复进样6次，测定峰面积的积分值，结果其RSD<3%，表明该方法具有较好的精密度。

稳定性试验：精密吸取供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样20 μL，测定峰面积的积分值，结果RSD<3%，表明供试品溶液中上述几种成分在24 h内具有较好的稳定性。

重复性试验：精密称取同一样品6份，每份0.5 g，按1.2.5项下供试品溶液配制方法进行提取处理后，各精密进样20 μL，测定含量，结果RSD<3%，表明本方法重复性良好。

加样回收试验：精密称取已知含量的样品5份，每份0.25 g，精密加入对照品适量，按供试品溶液的制备方法制备并分析，计算回收率为100.68%。

④样品含量测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，按上述色谱条件进行测定，计算其中5-HMF含量。

2 结果与分析

2.1不同温度贮藏过程中金银花pH值的变化

金银花贮藏过程中溶液pH值的变化情况如图2所示。随着贮藏时间的延长，温度的升高，整个金银花溶液pH值呈下降趋势。下降速率与温度呈正相关，即温度越高，下降速率越大(75℃>65℃>55℃>45℃)。

图2 金银花贮藏过程中pH值的变化情况

2.2不同温度贮藏过程中金银花的颜色变化及A420nm值

金银花贮藏过程中的暗度值、色差值、褐变指数、A420nm值变化情况如图3—图6所示。随着贮藏时间的延长和温度的升高，金银花暗度值100-L*、褐变指数BI呈上升趋势，与贮藏前的色差值也逐渐增大，说明金银花在贮藏过程中发生了褐变反应。用分光光度法测定金银花提取液在420 nm下的吸光度作为褐变值，确定褐变程度的差异，结果表明，在金银花贮藏过程中A420nm值上升，褐变程度加深，温度越高，变化越显著。

图3金银花贮藏过程中暗度值变化情况

图4 金银花贮藏过程中色差值变化情况

图5 金银花贮藏过程中BI值的变化情况

图6 金银花贮藏过程中A420nm值的变化情况

2.3不同温度贮藏过程中金银花氨基酸含量的变化

金银花贮藏过程中的氨基酸含量变化情况如图7所示。随贮藏时间的延长和温度的增高，氨基酸含量整体呈下降趋势，且下降速率随贮藏温度的升高而升高，同时贮藏312 h时，75℃处理的氨基酸含量不足45℃处理的一半。

2.4不同温度贮藏过程中金银花还原糖含量的变化

金银花贮藏过程中还原糖含量变化情况如图8所示。随贮藏时间的延长和温度的升高，还原糖含量整体呈下降趋势，且下降速率随贮藏温度的升高而升高。

图7 金银花贮藏过程中氨基酸含量的变化情况

图8 金银花贮藏过程中还原糖含量的变化情况

2.5 5-HMF含量变化

由图9可知，金银花在45℃下5-HMF含量缓慢升高，312 h后增加了1.27倍，55℃ 312 h后增加了7.6倍，65℃ 312 h后增加了22.5倍，75℃ 312 h后增加了112.1倍。贮藏温度每升高10℃，反应速度加快3～5倍，312 h后，75℃贮藏下的5-HMF含量是45℃下的49.81倍。

图9 金银花贮藏过程中5-HMF含量的变化情况

3 讨论与结论

3.1 金银花在贮藏过程中，随着贮藏时间的延长和温度的升高，药材颜色加深，暗度和褐变指数增大，表明在贮藏过程中发生了褐变反应且有有色成分生成。同时，随着金银花褐变程度加重，金银花提取液的A420nm值稳定增加，说明金银花在贮藏过程中，生成的有色成分为类黑素。

3.2 在金银花贮藏过程中，随着金银花褐变程度加深，氨基酸和还原糖含量显著减少，说明二者可能为褐变过程中的初始反应物。同时，金银花水提液pH值在贮藏过程中逐渐减小，其原因可能是由于氨基酸生成甲酸、乙酸所致[6]。

3.3 在金银花贮藏过程中，随着金银花褐变程度加深，中间产物5-HMF逐渐积累，且温度每升高10℃，褐变反应加快3～5倍，说明5-HMF可能为褐变反应的中间生成物，且5-HMF生成量和褐变速度密切相关。

3.4 综上所述，在金银花贮藏过程中，随着时间延长，温度升高，金银花发生了褐变反应，生成了有色物质类黑素和中间产物5-HMF，且初始反应物为氨基酸和还原糖，从而证实金银花褐变过程中发生了美拉德反应。

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ResearchonMaillardReactionduringStorageofLoniceraejaponicaeFlos

Wang Lingna1, Sun Xifang2, Zhang Fang1, Zhang Yongqing1

(1.CollegeofPharmacy,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China； 2.ShandongMedicineTechnicianCollege,Taian271016,China)

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.09.016

2017-03-08

国家科技支撑计划项目“金银花规范化种植基地优化升级及系列产品综合开发研究”(2011BAI06B01)；山东省自主创新专项“金银花资源高值产品开发与质量控制技术研究”(2013CXC20401)；山东省重点研发计划项目(2016GGB14409)；国家中医药标准化项目“金银花标准化建设”(2YB2H-Y-SD-32)

王玲娜(1990—)，女，陕西延安人，在读博士研究生，研究方向为中药资源及其质量控制。E-mail:wanglingna88@163.com

张永清(1962—)，男，山东平邑人，博士，教授，博士生导师，从事中药资源及其质量控制研究。E-mail:zyq622003@126.com

S567.7+90.3

A

1001-4942(2017)09-0082-06