杨翠翠，崔冰，张一卉，李景娟，李化银，刘立锋，王凤德，高建伟

(1.山东省农业科学院蔬菜花卉研究所/山东省设施蔬菜生物学重点实验室/国家蔬菜改良中心山东分中心，山东 济南 250100；2.山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250100； 3.曹县第一中学， 山东 菏泽 274200)

大白菜BrTILs基因鉴定及功能分析

杨翠翠1,3，崔冰1,2*，张一卉1，李景娟1，李化银1，刘立锋1，王凤德1，高建伟1

(1.山东省农业科学院蔬菜花卉研究所/山东省设施蔬菜生物学重点实验室/国家蔬菜改良中心山东分中心，山东 济南 250100；2.山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250100； 3.曹县第一中学， 山东 菏泽 274200)

温度诱导载脂蛋白(temperature induced lipocalin, TIL)在调控植物生长发育以及抗逆境胁迫方面具有重要作用。本研究利用生物信息学方法，从大白菜基因组中鉴定获得4个TILs基因(被命名为BrTILs)，它们不均匀分布在大白菜2、3、10号染色体上。通过对其基因和蛋白特征的分析发现，BrTILs基因编码区序列长414～750 bp，预测编码蛋白氨基酸长度为137～249 aa，分子量15.71～28.41 kD，等电点4.90～9.25。通过多重序列比对发现，BrTILs基因不同成员的DNA序列存在高度的相似性，但不同成员的exon/intron结构存在较大差异。利用RT-qPCR技术对BrTILs基因的表达模式进行分析发现，不同成员在不同组织中的表达以及对温度胁迫的响应模式方面存在较大差异，这可能与它们的启动子区具有不同的顺式响应元件有关。在拟南芥中过量表达BrTIL2和BrTIL4基因发现，虽然它们的表达模式存在较大差异，但是二者在抗温度和盐胁迫中的功能相似。过量表达BrTIL2和BrTIL4基因都不能提高转基因植株对温度胁迫的基础抗性，但二者均可提高转基因植株对盐胁迫的抗性。本研究不仅为我们全面了解大白菜TILs基因功能奠定基础，也为大白菜抗逆分子育种提供了重要参考。

大白菜；TIL基因；温度胁迫；盐胁迫

AbstractThe temperature induced lipocalin (TIL) protein plays an important role in the regulation of plant growth and development as well as the resistance to various stresses. In this study, four TIL genes were identified from the Chinese cabbage genome by bioinformatics method, and they were unevenly distributed on the Chinese cabbage chromosomes of A02, A03 and A10. Through the analysis of their gene and protein characteristics, it was found that the coding region of the four TIL genes were 414～750 bp, the predicted amino acid length were 137～249 aa, the molecular weight were 15.71～28.41 kD, and the pI value were 4.90～9.25. The multiple sequence alignment revealed that the DNA sequences of differentBrTILswere highly similar, while their exon/intron structures were largely different. Furthermore, the expression pattern ofBrTILgenes were analyzed using real-time quantitative PCR method (qRT-PCR). It was shown that differentBrTILshad different expression patterns in different tissues of Chinese cabbage and the response patterns to temperature stress were also different, which might be related to different cis-elements in their promoter regions. The over-expression ofBrTIL2 andBrTIL4 genes inArabidopsisrevealed that they both had similar functions in response to temperature and salt stress although their expression patterns had big differences. For example, over-expression ofBrTIL2 andBrTIL4 genes could not improve the resistance to temperature stress, but could enhance the resistance to salt stress. This study not only provides a basis for the comprehensive understanding of the function ofTILgenes in Chinese cabbage, but also provides important references for their applications in molecular breeding of Chinese cabbage.

KeywordsChinese cabbage;TILgene; Temperature stress; Salt stress

载脂蛋白(lipocalins)是一个古老的、功能多样的蛋白家族，广泛存在于动物、植物以及微生物中[1-5]。2002年，人们从小麦和拟南芥中分离鉴定出第一个植物载脂蛋白[6]。由于植物载脂蛋白受温度胁迫诱导而显著表达，因此又被命名为温度诱导载脂蛋白(temperature induced lipocalin, TIL)。近几年的研究表明，TIL在调控植物生长发育以及抗温度胁迫、盐胁迫和氧化胁迫等过程中发挥重要作用[7-11]。

大白菜(BrassicarapaL. ssp.pekinensis)起源于中国，是我国分布最广、种植面积最大的蔬菜作物，常年种植面积2×106公顷左右，素有“国菜”之称。多年的生产实践表明，大白菜不耐高温、冷冻，对高盐、干旱等逆境胁迫也非常敏感。因此，挖掘与大白菜抗逆境胁迫相关的基因并用于大白菜分子设计育种将有助于培育具有较强逆境胁迫抗性的大白菜新品种。基于TIL基因已取得的研究进展，本研究拟对大白菜TILs基因的组成、表达模式以及功能等进行系统分析，以期为大白菜抗逆分子设计育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1植物材料

大白菜(BrassicarapaL. ssp.pekinensis)为山东地方品种福山包头，拟南芥为哥伦比亚野生型(Col-0)。

1.2BrTILs基因鉴定及分析

以拟南芥AtTIL(AT5G58070)蛋白序列为探针在大白菜基因组数据库(Brassicadatabase，http://brassicadb.org/brad/)[12,13]中进行BlastP检索，参数默认。然后利用基因ID号下载所有BrTILs成员的DNA和蛋白序列用于后期分析。

利用ProtParam在线软件(http://web.expasy.org/protparam/)分析BrTILs蛋白的氨基酸长度、分子量及等电点等理化性质；利用Gene Structure Display Server在线分析软件(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析BrTILs基因的exon/intron组成结构；利用大白菜基因组数据库中的syntenic gene在线分析工具(http://brassicadb.org/brad/searchSyntenytPCK.php)分析拟南芥和大白菜TILs基因之间的共线性关系；利用DNAMAN 6.0.40软件对拟南芥和大白菜TILs基因序列进行多重比对分析；利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析软件对BrTILs基因起始密码子上游1.5 kb范围进行顺式响应元件分析。

1.3 RNA提取及反转录

RNA提取和反转录分别采用Trizol总RNA提取试剂盒(Invitrogen，美国)和cDNA第一链合成试剂盒(TaKaRa，大连宝生物)，步骤按试剂盒说明书进行。

1.4表达模式分析

BrTILs基因在不同组织器官中的表达模式分析：分别提取包心初期(23～25叶期)根、茎、莲座叶、包叶以及开花期盛开的花、受精后10天的果荚和花蕾的总RNA，然后以反转录产物为模板，以大白菜Actin基因为内参，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分析其表达模式，所用引物如表1。

BrTILs基因对高温和低温胁迫的响应模式分析：将种子表面消毒后播种于装满营养土(草炭土∶蛭石=1∶3)的小花盆(7 cm×7 cm)内，每盆4棵，然后20℃、16 h光照/8 h黑暗条件下培养，待长出第三片真叶时(约两周)，进行高温(35℃)和低温(4℃)胁迫处理，并在处理0、1、3、6、9、12 h时分别取样。提取总RNA，以反转录产物为模板，以大白菜Actin基因为内参，利用RT-qPCR方法分析其表达模式，所用引物如表1。

表1实时荧光定量PCR引物

1.5基因克隆

根据BrTILs基因序列设计克隆引物如下：BrTIL2-F:5′-CGGGATCCGGAAGAAAAGATGACGC-AA-3′, BrTIL2-R:5′-GCTCTAGACTGTAACTATT-TGCCGAACATAGA-3′; BrTIL4-F:5′-CGGGATCC-GAGAAGAAAAGATGACGTCGACGGA-3′, BrTIL4-R:5′-GCTCTAGAGCGTCCATGTGTATCTACTTGCCG-A-3′，带下划线碱基分别为BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点。

以cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物分别连接到克隆载体pMD18-T(TaKaRa，大连宝生物)上，转化大肠杆菌，测序鉴定。

1.6植物表达载体构建

用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ(TaKaRa)分别双酶切含目的基因的克隆载体和植物表达载体pCAMBIA-2300，然后电泳、切胶回收目的基因片段和线性pCAMBIA-2300植物表达载体，最后用T4 DNA连接酶(TaKaRa)连接回收片段。

1.7转基因植株的获得及表型分析

首先将构建的植物表达载体转化农杆菌感受态细胞，然后利用浸渗花蕾法转化野生型拟南芥。通过卡那霉素抗性筛选、PCR扩增的方法，经过至少两代以上的筛选鉴定获得分别过量表达BrTIL2和BrTIL4的转基因拟南芥纯合体植株。

低温胁迫处理：将正常条件下(20℃、16 h光照/8 h黑暗)生长30 d的转基因拟南芥转入4℃培养箱(16 h光照/8 h黑暗)培养48 h，然后测定光系统Ⅱ最大光化学效率(Fv/Fm)。

高温胁迫处理：将正常条件下生长30 d的转基因拟南芥转入40℃培养箱(16 h光照/8 h黑暗)培养24 h，然后测定Fv/Fm值。

NaCl胁迫处理：利用200 mmol/L NaCl溶液处理正常条件下生长30 d的转基因拟南芥，处理21 d后测定Fv/Fm值。

Fv/Fm值采用便携式荧光仪(Handy PEA)测定，测定时将Handy PEA光源强度调整为 3 000 μmol/(m2·s)(饱和光强)，作用光为波峰650 nm的红光，荧光信号记录时程2 s。另外，测定前需将植株叶片暗适应至少30 min。

上述试验均以转空载体植株(vector)作为对照。

2 结果与分析

2.1BrTILs基因鉴定及序列分析

以拟南芥TIL(AT5G58070)蛋白的氨基酸序列为探针，利用BlastP技术对大白菜基因组数据库(http://brassicadb.org/brad/)进行搜索，共获得4个大白菜TILs基因(基因ID分别为：Bra020391、Bra020393、Bra006784和Bra002674)，根据它们在染色体上的相对位置分别命名为BrTIL1、BrTIL2、BrTIL3和BrTIL4(表2)。进一步分析发现，4个BrTILs基因的编码序列(CDS)长度为414～750 bp，预测编码的氨基酸序列长度为137～249 aa，分子量为15.71～28.41 kD，等电点为4.90～9.25。

表2大白菜BrTILs基因及其编码蛋白特征分析

基因基因号染色体正反链所在位置编码序列蛋白长度(aa)分子量(kD)等电点BrTIL1Bra020391A02+5501909/550386475024928.414.90BrTIL2Bra020393A02+5507094/550774056418721.566.10BrTIL3Bra006784A03+5039845/504049556418721.435.97BrTIL4Bra002674A10_8365381/836579441413715.719.25

利用DNAMAN软件对大白菜和拟南芥TILs基因的核苷酸序列进行多重比对发现，BrTILs与AtTIL基因之间具有较高的序列一致性和保守性，其中BrTIL2与AtTIL基因之间的序列相似性高达85.64%(图 1)。这种序列上的高度一致性说明它们可能具有相似的生物学功能。

图1大白菜与拟南芥TILs基因序列多重比对分析

大白菜和拟南芥都属于十字花科植物，二者具有较近的亲源关系和良好的基因组共线性关系[14]。根据Brassicadatabase中共线性数据(http://brassicadb.org/brad/searchSynteny.php)可知，BrTIL1、BrTIL3和BrTIL4与AtTIL属于共线性基因，而BrTIL1和BrTIL2则属于串联重复基因。

另外，通过对拟南芥和大白菜TILs基因的exon/intron结构分析发现，AtTIL、BrTIL2和BrTIL3基因含有1个内含子，BrTIL1基因含有2个内含子，而BrTIL4基因则不含有内含子(图 2)。

图2拟南芥和大白菜TILs基因的exon/intron结构分析

2.2BrTILs基因启动子区顺式响应元件分析

为了研究BrTILs基因的生物学功能，我们利用PlantCARE在线分析软件对其起始密码子(ATG)上游1.5 kb序列进行了分析。发现BrTILs基因启动子区除了都含有TATA-box和CAAT-box外，还有多个其它顺式响应元件。但不同BrTILs基因启动子区所含有的顺式响应元件的种类和数量存在较大差别。例如，BrTIL1基因启动子区不存在HSE顺式响应元件，而BrTIL2、BrTIL3和BrTIL4则分别存在4、1、2个HSE顺式响应元件。这种顺式响应元件种类和数量的不同暗示不同基因在调控植物生长发育及响应外界胁迫的过程中可能发挥不同的作用。

表3大白菜和拟南芥TILs基因启动子区顺式响应元件分析

注：ABRE (cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness)、ARE (cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction)、ERE (ethylene-responsive element)、CAT-box (cis-acting regulatory element related to meristem expression)、G-box (cis-acting regulatory element involved in light responsiveness)、GARE-box (gibberellin-responsive element)、GT1-motif (light responsive element)、HSE (cis-acting element involved in heat stress responsiveness)、MBS (MYB binding site involved in drought-inducibility)、TCA-element (cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness)、TGA-element (auxin-responsive element)、circadian (cis-acting regulatory element involved in circadian control)。

2.3BrTILs基因表达模式分析

2.3.1BrTILs在不同组织器官中的表达模式 利用RT-qPCR方法对BrTILs基因在不同组织器官中的表达模式进行分析发现，不同BrTILs基因的表达模式存在显著差异。其中，BrTIL1基因在所有被检测组织中均未见表达；BrTIL2和BrTIL3基因均在结球初期的成熟叶中表达量最高，但分别在根和花蕾中表达量最低；BrTIL4基因则在盛开的花中表达量最高，在短缩茎中表达量最低。这种组织表达的特异性可能暗示不同成员在调控大白菜器官发育过程中发挥不同的作用。

图3 大白菜TILs基因在不同组织中的表达模式

2.3.2BrTILs基因对高温和低温处理的响应模式 如图4所示，在高温和低温处理后均检测不到BrTIL1基因的转录表达(未作图)；高温处理诱导BrTIL2基因的转录表达，而抑制BrTIL4基因的表达；低温处理诱导BrTIL4基因的转录表达，而抑制BrTIL2基因的表达；高温和低温处理都抑制BrTIL3基因的转录表达。这些结果说明不同BrTILs基因在响应大白菜温度胁迫中可能发挥不同的作用。

图4 大白菜TILs基因对高温和低温处理的响应模式

2.4过量表达BrTIL2和BrTIL4基因对转基因拟南芥耐温度胁迫的影响

待植株长到7～8片叶时，分别对转空载体(vector)、过量表达BrTIL2和过量表达BrTIL4基因的拟南芥进行40℃高温和4℃低温处理。然后在高温处理24 h和低温处理48 h时测定过量表达和对照植株的Fv/Fm值。结果表明，在高温和低温处理后，对照和BrTIL2和BrTIL4转基因植株的Fv/Fm值都有不同程度的降低。但比较发现，对照与过量表达BrTIL2和BrTIL4植株之间的Fv/Fm值并不存在显著差异(表4和表5)。说明过量表达BrTIL2和BrTIL4基因并没有显著改变拟南芥的基础耐热性和耐冷性。

2.5过量表达BrTIL2和BrTIL4基因对转基因拟南芥耐NaCl胁迫的影响

待植株长到7～8片叶时，用200 mmol/L NaCl溶液处理对照、过量表达BrTIL2和过量表达BrTIL4基因的拟南芥植株，处理21 d时测定Fv/Fm值。结果表明，200 mmol/L NaCl处理21 d时，对照、BrTIL2和BrTIL4转基因拟南芥植株的Fv/Fm值都明显降低，说明盐胁迫对对照和转基因植株都造成了伤害。但比较发现，过量表达BrTIL2和BrTIL4基因植株的Fv/Fm值显著高于对照，说明过量表达BrTIL2和BrTIL4基因提高了转基因植株对NaCl胁迫的抗性。

表4 过量表达BrTIL2基因对温度胁迫下拟南芥Fv/Fm值的影响

注：试验结果以平均值±标准差表示，转基因株系与野生型之间的差异显著性用两组数据的成组数据t检验进行分析，标记“ns”表示差异不显著，标记“*”表示差异显著(P<0.05)，标记“**”表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

表5 过量表达BrTIL4基因对温度胁迫下拟南芥Fv/Fm值的影响

表6过量表达BrTIL2和BrTIL4基因对NaCl胁迫下拟南芥Fv/Fm值的影响

3 讨论与结论

大白菜与拟南芥同属于十字花科植物，在进化上具有较近的亲缘关系。但是拟南芥基因组中仅有一个TIL成员[15]，而我们从大白菜基因组中鉴定得到4个TILs成员。Wang等[12]的研究认为，大白菜和拟南芥起源于共同的祖先，然而在进化过程中大白菜基因组发生了3倍化复制。此外，在进化过程中BrTIL1基因自身也发生了一次复制并形成BrTIL2基因，从而最终导致大白菜基因组中存在4个TILs基因。

通过序列比对发现，BrTILs基因之间存在高度的序列保守性。但通过表达模式分析发现，4个BrTILs基因之间的表达模式存在较大的差异，说明不同的大白菜TIL成员在调控大白菜生长发育及响应逆境胁迫过程中可能是通过不同的方式实现的。另外，通过对不同成员启动子区顺式响应元件的分析也部分证明了上述推测，因为不同BrTILs基因启动子区的顺式响应元件的数量和种类存在显著差异。

光合作用对胁迫伤害最为敏感，因此逆境环境中光合作用的提高是植物抗逆性增强的重要表现[16-18]，而光系统Ⅱ的Fv/Fm值则可以作为探测光合作用强弱的探针[19]。在本研究中，高温和低温处理后不同基因型拟南芥的Fv/Fm值都不同程度降低，但它们之间并未表现出显著差异，说明过量表达BrTIL2和BrTIL4基因并没有显著提高转基因植株对温度胁迫的抗性，这与Chi等[7]的研究结果一致。Chi等研究发现，AtTIL1基因功能缺失会导致植株耐热性缺陷，但过量表达AtTIL1基因并不能显著提高转基因植株的耐热性。也就是说，AtTIL1对于高温下植物的耐受性是必需的，但其本身又不足以抵抗热胁迫。

Abo-Ogiala等[11]研究发现，AtTIL可以在盐胁迫条件下保护叶绿体免受盐离子的毒害。在本研究中，我们也得到了类似的结果，盐胁迫条件下，过量表达BrTIL2和BrTIL4基因的拟南芥植株的Fv/Fm值显著高于野生型，说明过量表达BrTILs基因能显著提高转基因植株的耐盐性。

总之，本研究不仅为我们全面了解大白菜TILs基因功能奠定了基础，也为大白菜抗逆分子育种提供了重要参考。

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IdentificationandFunctionalAnalysisofBrTILGenesinChineseCabbage(BrassicarapaL.ssp.pekinensis)

Yang Cuicui1,3, Cui Bing1,2*, Zhang Yihui1, Li Jingjuan1, Li Huayin1, Liu Lifeng1, Wang Fengde1, Gao Jianwei1

(1.InstituteofVegetablesandFlowers,ShandongAcademyofAgriculturalSciences/ShandongProvincialKeyLaboratoryofGreenhouseVegetableBiology/ShandongBranchofNationalVegetableImprovementCenter,Jinan250100,China; 2.CollegeofLifeSciences,ShandongNormalUniversity,Jinan250100,China; 3.CaoxianNo.1SeniorHighSchool,Heze274200,China)

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.09.003

2017-05-12

山东省自然科学基金项目(ZR2015YL071)；国家自然科学基金项目(31471884)；山东省农业科学院青年英才计划项目(NKYSCS-01)；山东省现代农业产业技术体系蔬菜创新团队遗传育种岗位(SDAIT-05-04)；山东省农业科学院创新工程项目(CXGC2016A02)

杨翠翠(1988—)，女，硕士研究生，主要从事蔬菜分子生物学研究。E-mail: cuixuncui@126.com 崔冰(1990—)，男，硕士研究生，主要从事蔬菜分子生物学研究。E-mail: bice1981@sina.com *同等第一作者。

王凤德(1979—)，男，副研究员，主要从事蔬菜分子生物学研究。E-mail: wfengde@163.com 高建伟(1967—)，男，研究员，主要从事蔬菜遗传育种研究。E-mail: jianweigao3@qq.com

S643.1：Q78

A

1001-4942(2017)09-0012-07