黄大伟 陆定波Δ 高 翔 邓郭琳

1.湖北省中医院肝病科 (湖北 武汉， 430074) 2.湖北中医药大学2013级研究生班

·基础理论研究·

抗纤软肝颗粒调控Hedgehog通路核转录因子Gli1抑制肝星状细胞活化的研究*

黄大伟1陆定波1Δ高 翔1邓郭琳2

1.湖北省中医院肝病科 (湖北 武汉， 430074) 2.湖北中医药大学2013级研究生班

目的：探讨抗纤软肝颗粒调控Hedgehog(Hh)信号通路抑制HSC活化的作用机制。方法引进人肝星状细胞系HSC-LX2，常规培养及传代，设立空白对照组、模型组和抗纤软肝颗粒中、低剂量组。药物作用24h后收集细胞，测定各组Hh信号通路相关信号分子Gli1、Shh、Ptc、Smo的表达，转化生长因子-β1(TGF-β1)及PDGF-B的水平。结果模型组HSC细胞Hh信号通路相关信号分子Shh、Ptc、Smo、Gli1 mRNA表达均增高，与空白对照组比较，差异具有显著性意义(P<0.05)；抗纤软肝颗粒中、低剂量组Shh、Ptc、Smo、Gli1 mRNA表达较模型组减少，差异具有显著性意义(P<0.05)，各剂量组之间比较，差异无显著性意义。HSC诱导活化后，模型组TGF-β1及PDGF-B合成增加，与空白对照组比较差异具有显著性意义(P<0.05)；抗纤软肝颗粒中、低剂量组TGF-β1及PDGF-B合成较模型组下降，差异具有显著性意义(P<0.05)，各剂量组之间比较，差异无显著性意义。结论抗纤软肝颗粒能够下调Hh信号通路核转录因子Gli1及相关信号分子Shh、Ptc、Smo的表达，从而抑制HSC活化，减少TGF-β1、PDGF-B的合成。

肝纤维化；抗纤软肝颗粒；Hedgehog通路；Gli1

AbstractObjective:To study the mechanism of anti-hepatic fibrosis through Kangxian Ruangan granule regulating the Hedgehog (Hh) signaling pathway which activated Hepatic Stellate Cells (HSC) and inhibiting the activation of HSC.Methods:To introduce Human Hepatic Stellate Cell line HSC-LX2,culture and passage them in conventional methods. The expertment was divided into blank control group, model group and Kangxian Ruangan granule medium, low does group. Conventional cultured cells as the blank control group.For 24 hours. Followed, the cells were collected.The expression of Hh signaling pathway’s related signal molecules such as Gli1, Shh, Ptc and Smo and the effect of Kangxian Ruangan granule on HSC activation and synthesis of transforming growth factor-beta 1 (TGF-1) and PDGF-B were analyzed.Results:Compared with the blank control group,the expression of Hh signaling pathway’s related signal molecules include Shh, Ptc, Smo, Gli1 mRNA were increased in HSC cells of the model group, the difference was significant (P<0.05);The expression of Shh, Ptc, Smo, Gli1 mRNA in Kangxian Ruangan granule medium, low does group were lower than that in the model group (P<0.05), and there was no significant difference among different does groups; Compared with the blank control group, the synthesis of TGF-β1 and PDGF-B increased after HSCs activated by PDGF-BB in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the synthesis of TGF-β1 and PDGF-B decreased in Kangxian Ruangan granule medium, low does group (P<0.05).Conclusion:Kangxian Ruangan granule could regulate the expression of nuclear transcription factor Gli1 and its related signal molecules include Shh, Ptc and Smo of Hedgehog (Hh) signal pathway, and then inhibit the activation of HSCs and reduce the synthetise of TGF-β1and PDGF-B.

KeyWordsHepatic Fibrosis; Kangxian Ruangan granule; Hedgehog Pathway; Gli1.

抗纤软肝颗粒是我院肝病研究所的院内制剂，由名中医肝病专家张赤志教授创立。前期研究显示抗纤软肝颗粒能通过细胞因子途径、信号转导途径抑制肝呈状细胞(HSC)活化、促进HSC凋亡，进而抑制细胞外基质(ECM)的过度沉积，发挥抗肝纤维化作用。它能干扰血小板衍生生长因子(PDGF)在HSC的信号转导，阻断PDGF的生物学效应[1]，故推测抗纤软肝颗粒是Glil小分子抑制剂。本研究通过体外实验，探讨抗纤软肝颗粒对HSC中Hh信号通路核转录因子Gli1的调控作用。

1 材料和方法

1.1 研究材料

1.1.1 细胞系 肝星状细胞系HSC-LX2由上海中医药大学附属曙光医院刘成海教授惠赠，表现为静止的HSC。

1.1.2 药物 抗纤软肝颗粒为湖北省中医院院内制剂(批准文号：鄂药制字Z20113145)，由湖北省中医院制剂中心制备。临用时，以含10% 胎牛血清(美国GIBCO公司)的DMEM(高糖)培养基(美国GIBCO公司)充分溶解，分别制备浓度为5mg/ml、1.25mg/ml的药物溶液，采用孔径为0.22μm的微孔滤膜针头滤器抽滤除菌后4℃保存，1周内用完。

1.2 研究方法

1.2.1 HSC细胞传代培养 将人HSC-LX2细胞系接种至含10% 胎牛血清的DMEM(高糖)完全培养基中，37℃、5% CO2条件下培养，12h后首次更换培养基，以后每3天更换培养基一次，待细胞长满瓶底约90% 时以0.125% 胰蛋白酶-EDTA溶液消化、传代。

1.2.2 实验分组及样品处理 培养的HSC-LX2细胞分为空白对照组、模型组和抗纤软肝颗粒中、低剂量组。空白对照组为正常培养的HSC-LX2细胞，未做特殊处理，是静息状态的HSC细胞。模型组和抗纤软肝颗粒中、低剂量组细胞均分别给予10ng/ml PDGF-BB处理24h以诱导静息状态的HSC细胞活化，抗纤软肝颗粒中、低剂量组在PDGF诱导24h后再分别给予浓度5mg/ml、1.25mg/ml的抗纤软肝颗粒药物溶液处理24h。

1.2.3 实时荧光定量PCR法分析HSC细胞Hh信号通路相关信号分子和TGF-β1、PDGF-B mRNA的表达情况 各组细胞样品分别处理后，吸弃培养瓶内的培养基，加入适量4℃预冷的TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)，轻柔吹打数次以使贴壁细胞脱落，将含有细胞的TRIzol试剂转移至1.5ml EP管，酚-氯仿法提取总RNA，采用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)逆转录合成第一链cDNA，采用荧光实时定量PCR法(KAPA SYBR FAST qPCR试剂盒，美国Kapa Biosystems公司)测定各组细胞中Hh信号通路核转录因子Gli1及其他相关信号分子Shh、Ptc、Smo 以及HSC合成TGF-β1、PDGF-B mRNA的表达。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列见表1。

1.3 统计学方法 所有计量数据录入Excel表格，采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PDGF-BB诱导HSC活化 HSC细胞经PDGF-BB诱导后活化并增殖。实时荧光定量PCR法测定各组细胞合成TGF-β1、PDGF-B mRNA的表达量，以及各组细胞Hh信号通路关键因子Gli1、Shh、Ptc、Smo的表达量。以空白对照组细胞为对照，将该组TGF-β1、PDGF-B、Gli1、Shh、Ptc、Smo mRNA表达量视为1，采用相对定量2-ΔΔCt进行比较。HSC诱导活化后，模型组TGF-β1 mRNA相对空白对照组的表达倍数为3.55±0.20，显著高于空白对照组(P<0.05)；模型组PDGF-B mRNA相对空白对照组的表达倍数为3.81±0.09，显著高于空白对照组(P<0.05)；模型组细胞Hh信号通路关键因子Gli1、Shh、Ptc、Smo mRNA相对空白对照组的表达倍数分别为2.33±0.05、1.37±0.07、2.03±0.18、2.15±0.21，显著高于空白对照组(P<0.05)。

2.2 抗纤软肝颗粒对HSC合成TGF-β1、PDGF-B的影响 实时荧光定量PCR测定抗纤软肝颗粒中、低剂量组及模型组细胞合成TGF-β1、PDGF-B mRNA的表达量，以模型组细胞为对照，将该组TGF-β1、PDGF-B mRNA表达量视为1，采用相对定量2-ΔΔCt进行比较。抗纤软肝颗粒中、低剂量组TGF-β1 mRNA相对模型组的表达倍数分别为0.31±0.02、0.35±0.01，与模型组相比差异具有显著性意义(P<0.05)，各剂量组之间比较差异无显著性意义；抗纤软肝颗粒中、低剂量组PDGF-B mRNA相对模型组的表达倍数分别为0.19±0.01、0.36±0.02，与模型组相比差异具有显著性意义(P<0.05)，各剂量组之间比较差异无显著性意义(见表2、图1)。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

图1 抗纤软颗粒中剂量组(n=3)、低剂量组(n=3)细胞中TGF-β1、PDFG-B mRNA表达图

组别TGF-β1PDGF-B抗纤软肝颗粒中剂量组0.31±0.02*0.35±0.01*抗纤软肝颗粒低剂量组0.19±0.01*0.36±0.02*

注：模型组各项指标表达量视为1。(见2.2中内容)下表同。与模型组比较，*P<0.05

2.3 抗纤软肝颗粒对HSC细胞Hh信号通路关键信号分子表达的影响 以模型组细胞Hh信号通路相关信号分子的表达量为对照，将该组Gli1、Shh、Ptc、Smo mRNA表达量视为1，采用相对定量2-ΔΔCt进行比较。实时荧光定量PCR结果显示，抗纤软肝颗粒中、低剂量组Gli1 mRNA相对模型组的表达倍数分别为0.45±0.01、0.65±0.03，与模型组相比差异具有显著性意义(P<0.05)，各剂量组之间比较，差异无显著性意义；抗纤软肝颗粒中、低剂量组Shh mRNA相对模型组的表达倍数分别为1.12±0.03、1.09±0.10，与模型组相比，差异具有显著性意义(P<0.05)，各剂量组之间比较，差异无显著性意义；抗纤软肝颗粒中、低剂量组Ptc mRNA相对模型组的表达倍数分别为0.40±0.02、0.39±0.07，与模型组相比，差异具有显著性意义(P<0.05)，各剂量组之间比较，差异无显著性意义；抗纤软肝颗粒中、低剂量组Smo mRNA相对模型组的表达倍数分别为0.44±0.09、0.42±0.05，与模型组相比，差异具有显著性意义(P<0.05)，各剂量组之间比较，差异无显著性意义(见表3、图2)。

表3 抗纤软肝颗粒中、低剂量组Hh信号通路相关信号分子mRNA相对模型组表达量比较(2-ΔΔCt，mean±SD，n=3)

与模型组比较，*P<0.05

图2 抗纤软肝颗粒中剂量组(n=3)、低剂量组(n=3)细胞中Hh信号通路Glil、Shh、Ptc、Smo mRNA表达图

3 讨论

肝星状细胞(HSC)的异常活化是肝纤维化进展的核心环节，表现为表达α-SMA，产生TGF、PDGF、ANGⅡ等，最终形成纤维瘢痕。近年学者认识到经典的Hh信号通路与肝星状细胞的活化有关。实验研究表明：多种活化的HSC均表达Hh配体和Hh通路Shh、Patch、 Smo和Gli等多重组分[2]。

抗纤软肝颗粒是张赤志教授在我院已故名老中医吕继端教授临床经验的基础之上创立，张教授认为肝纤维化是肝硬化“证未显现”阶段，“肝络瘀阻、痰瘀互结”是这一阶段的总病机，从而确立以“痰瘀阻络”为核心的辨证治疗体系。抗纤软肝颗粒具有“化痰软坚、活血化瘀”之功效，现为我院自制中成药制剂，在我院肝炎肝硬化中医诊疗方案中作为代偿性肝硬化治疗常规用药。该药由海藻、鳖甲、牡蛎、莪术、丹参、山楂、地骷髅组成，具有“化痰软坚、活血化瘀”之功效。我们采用不同浓度的抗纤软肝颗粒干预经PDGF诱导活化的HSC，发现药物干预后，HSC中Hh信号通路核转录因子Gli1及其他Hh通路相关组分Shh、Ptc、Smo的相对表达量均下降，而各剂量组之间无明显差异。这一结果说明抗纤软肝颗粒对HSC中Hh信号通路具有调控作用，能下调Hh信号通路核转录因子Gli1和Hh信号通路关键因子Shh、Ptc、Smo的表达，从而抑制HSC活化，减少TGF-β1、PDGF-B的合成，这可能是其减轻肝纤维化病变程度、延缓病程进展的作用机制之一。

[1] 杨玲, 朱清静, 笪邦红, 等.中药抗纤软肝颗粒抑制PDGF诱导的肝星状细胞MEK-1和c-fos表达[J].世界华人消化杂志，2004，12(2):347-350.

[2] Taipale J, Chen JK, Cooper MK,etal. Effects of oncogenic mutations in smoothened and patched can be reversed cyclopamine [J].Nature，2000，206(6799):10005-1009.

StudyofKangxianRuanganGranuleregulatingHedgehogpathway’snuclearfactorGli1foranti-activationofhepaticstellatecells

HUANGDa-wei1,LUDing-bo1Δ,GAOXiang1,etal.

1.DepartmentofHepatologydiseases,HubeiHospitalofTraditionalChineseMedicine(WuhanHubei,430061)China

2016-09-03 编辑：黄育华)

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.01.013

湖北省卫生和计划生育委员会资助项目(No.2012Z-Y01)；Δ通讯作者,Email:ludingbo64@163.com