谷巧荣+艾俊杰+张倩云+董雅男+高强

摘要建立了一种以荧光标记脂质体为探针检测磷脂酶 C （PLC） 活性的新方法。此荧光探针是由二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）和丽丝胺罗丹明B标记的荧光磷脂（Liss Rhod PE）通过自组装形成有序的荧光标记脂质体，探针脂质体中Liss Rhod PE由于相互之间距离靠近产生自猝灭效应，因而作为探针的脂质体并不表现出荧光性质。当在此探针溶液中加入目标物PLC，PLC可以水解切割标记在磷脂酰基二位上的荧光团罗丹明，使其从脂质体释放到溶液中，导致自猝灭效应的减弱，溶液荧光信号增强，以此实现对PLC活性的检测。使用此探针检测PLC活性，荧光强度的增加值与PLC浓度在5～300 U/L范围内呈良好的线性关系，检出限为2 U/L（S/N=3）。此外，此探针还可用于PLC抑制剂的筛选。

[KH*3/4D][HTH]关键词荧光； 脂质体； 探针； 磷脂酶C； 抑制剂

1引 言

磷脂酶降解磷脂产生自由的脂肪酸、血溶性脂、胆碱和磷脂酸[1]。磷脂酶降解磷脂的过程包含了一系列生物作用，如新陈代谢、消化、炎症反应、膜运输、细胞间信号传导[1，2]。磷脂酶是一个大家族，磷脂酶C（PLC）是其中的重要一员，它可以催化水解磷脂分子中的磷酸酯键，水解产物为二酰基甘油和磷酸胆碱[3]。这种水解过程与一些癌细胞中异常的胆碱代谢有关[4]。因而快速、灵敏的检测体液中的PLC活性极为重要。

目前，常见的检测PLC酶活性的方法有核磁共振法[5]、比浊法[6]、放射性测定法[7]、色谱法[8]等，上述方法各具特色且大都具有较高的灵敏度，但通常需要昂贵的仪器且操作繁琐。因此，简单、灵敏的检测磷脂酶活性的方法越来越为人们所关注。近年来，荧光光谱法因其具有灵敏、快速和操作简单的优点而被广泛应用于酶活性检测和酶抑制剂的筛选研究[9]。除了常规的分析方法，基于功能化的纳米粒子的荧光法也已被应用于磷脂酶活性检测。如Sun 等合成了具有荧光的功能化金纳米簇，利用荧光光谱法测定了酸性磷酸酶[10]、乙酰胆碱酯酶[11]和焦磷酸酶[12]的活性。Liu等[13]将罗丹明标记磷脂组装到石墨烯两侧，利用石墨烯猝灭罗丹明荧光制得了纳米探针。在磷脂酶D存在时，磷脂酶D切割磷脂释放罗丹明，体系荧光增强。据此实现了磷脂酶D活性的高灵敏检测。Chen等[14]使用磷脂分子和金纳米粒子制备了一种具备荧光性质的脂质体金纳米粒子复合物， PLC可以切割磷脂分子破坏脂质体复合物，减小氧自由基对探针荧光的抑制，通过检测荧光的增强实现了PLC活性的检测。作为磷脂酶的天然底物，利用荧光标记的磷脂分子形成的脂质体探针正越来越多的被用于磷脂酶的检测[15]以及药物载体[16]。相对于游离的脂质体，磷脂酶对形成脂质体的磷脂通常具有更高的催化活性。本研究采用荧光分子罗丹明标记的磷脂通过混合自组装制备了脂质体荧光探针，罗丹明因自猝灭效应并不表现出明显的荧光。利用PLC水解构成脂质体的磷脂释放荧光分子罗丹明，通过荧光增强实现了PLC活性的检测。

2实验部分

2.1仪器与试剂

F7000荧光仪（日本日立公司）；Zetasizer NanoZS90激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）。

二棕榈酰磷脂酰胆碱（1，2Dipalmitoylsnglycero3phosphocholine，DPPC）和丽丝胺罗丹明B标记的磷脂酰乙醇胺（1，2Dimyristoylsnglycero3phosphoethanolamineN（lissamine rhodamine B sulfonyl） （ammonium salt），Liss Rhod PE）均购自Avanti Polar Lipids公司；磷脂酶C（PLC，来源于产气荚膜梭菌）、曲通X100和羟乙基哌嗪乙硫磺酸 （HEPES）（SigmaAldrich公司）；PLC酶抑制剂U73122（Selleck公司）； CaCl2（西安化学试剂厂）。所用试剂均为分析纯，缓冲溶液和储备溶液均使用超纯水（Millipore MilliQultrapureQ，>18.2 MΩ cm）配制。

2.2实验方法

2.2.1探针的制备将0.2 mg Liss Rhod PE （200 μL 1 mg/mL儲备液）、0.8 mg DPPC（32 μL 25 mg/mL储备液）的氯仿溶液混合，在超声条件下逐滴加入到3 mL水中，超声至溶液均匀， 避光放置过夜，即得到荧光脂质体探针， 4℃保存。

2.2.2荧光检测将50 μL PLC加入到100 μL 10.0 mmol/L HEPES（含2 mmol/L CaCl2，pH=7.4）缓冲液和50 μL探针的混合液中，室温下检测其荧光强度并记录数据。荧光检测条件：扫速240 nm/min，激发波长530 nm，激发和发射狭缝宽度5 nm，PMT=700 V，荧光测定使用1 mm×10 mm荧光比色皿。

2.2.3钙离子的影响在原有10.0 mmol/L HEPES（含2 mmol/L CaCl2， pH=7.4）缓冲溶液中加入5 mmol/L EDTA，并在此缓冲液中按上述步骤测定加入100 U/L PLC对探针液进行水解后的荧光强度。

2.2.4抑制剂实验将不同浓度的U73122与浓度为100 U/L PLC培养20 min后，将其混合液加入到探针液中进行荧光强度测定。

3结果与讨论

3.1实验原理图

使用二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）和罗丹明B标记的荧光磷脂（Liss Rhod PE）制备荧光标记脂质体探针，用于PLC活性的检测。检测原理如图1所示，当DPPC和Liss Rhod PE通过自组装形成脂质体，荧光标记分子罗丹明之间的距离被拉近，出现荧光自猝灭现象。脂质体探针并不表现出荧光性质。当PLC存在时，PLC催化水解磷脂释放出荧光分子罗丹明，使得强荧光物质罗丹明B[17]荧光得以恢复。基于罗丹明B荧光的增强实现PLC活性的检测，这一探针也可用于PLC抑制剂的筛选。endprint