潘 坤 戴爱国 张泽明 赵学琴 陈 露 孟子卜

(河北大学附属医院呼吸内科，河北 保定 071000)

·呼吸、消化系统疾病·

OS-9、HIF1α在慢性阻塞性肺疾病患者中的表达及临床意义

潘 坤 戴爱国1张泽明 赵学琴 陈 露 孟子卜

(河北大学附属医院呼吸内科，河北 保定 071000)

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者及非COPD患者OS-9、低氧诱导因子(HIF1)α表达变化情况及其临床意义。方法应用原位杂交法观察OS-9 、HIF1α mRNA在气管壁小动脉壁的表达，免疫组织化学法检测肺血管壁OS-9、HIF1α蛋白质表达水平。结果COPD患者肺血管壁OS-9 mRNA及蛋白表达较非COPD组均降低(P<0.05)，COPD患者HIF1α mRNA及蛋白表达较非COPD组均升高，以蛋白升高更明显。直线相关分析表明，OS-9蛋白与HIF1α蛋白表达呈负相关(r=-0.596，P<0.05)。结论OS-9或许可通过加强羟化酶的活性来调节HIF1α的表达，作为HIF1α的负相调控因子在COPD的发生发展中发挥作用。

OS-9；低氧诱导因子；慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的患病率占40岁以上人群的8.2%〔1〕，是 低 氧 性 肺 动 脉 高 压的常见病因。低氧诱导因子(HIF)1α在低氧条件下发挥重要调节作用，人类很多疾病的发生都与HIF1α转录水平和蛋白表达水平变化有关。HIF1α在低氧大鼠及COPD患者肺动脉高压形成过程中发挥重要作用〔2〕。脯氨酰羟化酶(PHDs)是HIF降解的催化酶，在其降解过程中发挥关键作用。体外培养细胞实验发现OS-9可与HIF1α、PHDs结合，通过增强PHDs的酶活性促进HIF1α的降解。本实验拟分析OS-9、HIF1α在COPD患者中的表达及临床意义。

1 资料和方法

1.1一般资料 从湖南省老年医院、常德市第一人民医院选取新确诊肺部肿瘤的患者28例，均行肺叶切除术。所有入选病例按照要求做胸部CT和肺通气功能检查，根据COPD诊断标准(2007年中华医学会制定)分为COPD组和非COPD组。COPD组12例，男8例，女4例；年龄(60.5±6.8)岁；肺通气功能分级：轻度5例，中度7例。非COPD组14例，男8例，女6例；年龄(58.4±8.7)岁；两组年龄、性别、标本取材部位等方面均无统计学差异(P>0.05)。

1.2肺动脉壁中OS-9和HIF1α mRNA的检测 将肺组织样本在4%多聚甲醛/0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中固定2 h，制成石蜡切片，用胃蛋白酶处理石蜡切片以暴露mRNA核酸片段。 在38℃湿盒中预杂交2 h后，将杂交探针加入到样品中。 38℃湿盒杂交16 h，干环境孵育杂交2 h，冲洗并进行封闭，将地高辛抗体加入到标本中，二氨基联苯胺(DAB)及苏木精染色，最后进行脱水并封闭观察。根据血管壁的染色程度来判断阳性及阴性表达结果，染色颜色越深，相对表达值越高。应用肺动脉壁图像分析软件测得肺血管壁平均吸光度，根据此定量资料比较两组表达是否具有统计学意义。

1.3OS-9和HIF1α蛋白在肺动脉壁中的表达分析 将样本用中性甲醛固定，按照常规程序制作石蜡切片。石蜡切片和过氧化物酶封闭溶液在室温下孵育10 min，胰蛋白酶在37℃下孵育20 min以进行抗原修复，之后样品在室温下继续温育5 min。最后根据试剂盒的操作说明书滴加抗体，DAB、苏木精依次染色，脱水封闭观察血管壁。应用肺动脉壁图像分析软件测得肺血管壁平均吸光度，作为比较OS-9和HIF1α蛋白在两组表达是否具有统计学意义的定量资料。

1.4统计学方法 应用SPSS16.0软件进行t检验、直线相关回归法。

2 结 果

2.1OS-9 mRNA及蛋白质在COPD组和非COPD组肺血管壁中的表达变化 非COPD组中，OS-9 mRNA及蛋白表达为阳性或强阳性，而在COPD组中OS-9 mRNA和蛋白的表达均显著降低(均P<0.01)。见表1。

2.2HIF1α mRNA及蛋白质在COPD组和非COPD组肺血管壁中的表达变化 HIF1α mRNA的表达在非COPD组肺血管壁中为弱阳性，同时还观察到一部分血管壁呈阳性，HIF1α mRNA在COPD患者中的表达呈阳性或强阳性，两组差异有统计学意义(P<0.05)。 非COPD组血管壁HIF1α蛋白表达为阴性或弱阳性，COPD患者血管壁表达阳性或强阳性，两组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组OS-9、HIF1α表达比较

3 讨 论

COPD是以不可逆气流受限为特征的临床疾病，患者一般存在呼吸衰竭并伴有低氧血症，低氧是肺动脉高压形成、肺血管重构最重要的功能性因素。HIF1α是机体适应低氧环境最重要的一类调控因子，在肺动脉高压形成及肺血管重构中也发挥着重要作用〔3〕。本实验说明低氧环境下COPD患者血管壁的HIF1α的翻译、转录均呈上升趋势，由此可推测出HIF1α表达增高可能与慢COPD的发病相关。

HIF1α蛋白降解有一个必要条件，即PHDs催化HIF1α氧依赖性降解区域两个脯氨酸残基羟基化。因此可知，可影响PHDs活性的调控因子均能间接影响HIF1α的表达。有学者体外实验发现OS-9可同时与HIF1α及PHDs结合，形成包含三者的复合物，通过增强PHDs的酶活性进而促进HIF1α的羟基化，并通过泛素蛋白酶体途径降解〔4〕。在同时转染OS-9、HIF1α、PHDs的细胞中，OS-9的表达增强了羟化酶的催化活性，并进一步促使HIF1α经泛素蛋白酶体途径降解。与此相反，在OS-9被抑制表达的细胞则发现HIF1α表达水平呈升高趋势，且其下游靶基因表达也同时增强。本实验发现OS-9 mRNA和蛋白质在非COPD组呈阳性/强阳性表达，COPD组表达均降低，而HIF1α在非COPD组呈弱阳性/阳性表达，COPD组表达升高，分析其原因可能是由于OS-9在COPD组表达降低，相对减弱了PHDs的酶活性，因此使得HIF1α蛋白表达增高。因此，OS-9在COPD患者中表达的动态变化可能影响了HIF1α的表达。OS-9或可通过影响PHDs的活性来间接调控HIF1α及其靶基因的表达，进而作为HIF1α的一个负相调节因子影响COPD的发病过程。OS-9由Su等〔5〕于1996年最早开始研究，其基因位于人染色体12q13-15区域，在人体组织细胞广泛表达，骨肉瘤患者中表达最明显。目前国内外关于OS-9功能的研究主要集中在其对非折叠蛋白通过内质网降解途径降解中发挥重要作用〔6～9〕。有关其在低氧条件下表达降低的机制还需进一步研究。Sun等〔10〕通过在胰腺癌患者和体外细胞的试验中发现，OS-9 mRNA和蛋白的表达可由一种长链非编码RNA(ENST00000480739)上调表达，荧光分析实验提示，这一机制可能是通过激活OS-9启动子的表达而实现的。但是，低氧条件是是否由于ENST00000480739表达降低从而导致OS-9表达下降还需进一步研究。

1Zhong N，Wang C，Yao W,etal.Prevalence of chronic obstructive pulmonary disease in China：a large，population-based survey〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2007；176(87)：753-60.

2蒋永亮，聂 金，刘 蕾，等.ING4、PHDs以及HIF-1α在低氧性肺动脉高压大鼠中的表达变化〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志，2014；23(2)：117-24.

3林 琳.老年慢性阻塞性肺疾病患者外周血HIF-1α、IL-18、Th17和Treg的表达及与肺功能的关系〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(17)：4927-9.

4Baek JH，Mahon PJ，Kelly B，etal.OS-9 interacts with hypoxia-inducible factor 1 alpha and prolyl hydroxylases to promote oxygen-dependent degradation of HIF-1 alpha〔J〕.Mol Cell，2005；17(4)：503-12.

5Su YA,Hutter MC,Trent JM,etal.Complete sequence analysis of a gene (OS-9) ubiquitously expressed in human tissues and amplified in sarcomas〔J〕.Mol Carcinog，1996；15(4)：270-5.

6Tang HY,Huang CH,Zhuang YH，etal.EDEM2 and OS-9 are required for ER-associated degradation of non-glycosylated sonic hedgehog〔J〕.PLoS One，2014；9(6)：e92164.

7Schipanski A，Oberhauser F，Neumann M，etal.Lectin OS-9 delivers mutant neuroserpin to endoplasmic reticulum associated degradation in familial encephalopathy with neuroserpin inclusion bodies〔J〕.Neurobiol Aging，2014；35(10)：2394-403.

8Su W，Liu Y，Xia Y，etal.The Arabidopsis homolog of the mammalian OS-9 protein plays a key role in the endoplasmic reticulum-associated degradation of misfolded receptor-like kinases〔J〕.Mol Plant，2012；5(4)：929-40.

9Hosokawa N.OS-9 and XTP3-B：lectins that regulate endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD)〔J〕.Seikagaku,2011；83(1)：26-31.

10Sun YW，Chen YF，Li J，etal.A novel long non-coding RNA ENST00000480739 suppresses tumour cell invasion by regulating OS-9 and HIF-1α in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.Br J Cancer，2014；111(11)：2131-41.

〔2017-03-21修回〕

(编辑 袁左鸣)

R544

A

1005-9202(2017)19-4830-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.063

1 湖南省老年医院 老年医学研究所呼吸疾病研究室

戴爱国(1966-)，男，博士后，博士生导师，主任医师，主要从事慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等及疑难病的研究。

潘 坤(1981-)，女，硕士，主治医师，主要从事慢性阻塞性肺病及哮喘研究。