仇志富 吴晓光 颜 勇 李蒙蒙 张丽华

(承德医学院基础医学研究所，河北 承德 067000)

姜黄素对脑缺血大鼠脑组织PI3K/AKT信号通路的影响

仇志富 吴晓光 颜 勇 李蒙蒙 张丽华1

(承德医学院基础医学研究所，河北 承德 067000)

目的探究姜黄素对脑缺血大鼠脑组织PI3K/Akt信号转导通路的影响及机制。方法SD大鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量姜黄素组、高剂量姜黄素组，每组大鼠18 只。其中模型组、低、高剂量姜黄素慢性脑缺血大鼠模型的制备采用将大鼠两侧颈动脉结扎的方法进行，假手术组和模型组分别灌胃给予生理盐水。免疫组化法检测PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白的表达，干湿重法检测脑组织水含量，甲酰胺法检测血脑屏障通透性。结果同模型组比较，姜黄素组PI3K、AKT、Bcl-2蛋白表达均明显增高(P<0.05)，脑组织含水量、Bax蛋白表达及伊文思蓝含量显著降低(P<0.05)，高剂量姜黄素组效果优于低剂量姜黄素组。结论姜黄素对缺血性脑损伤的保护作用可能是其在降低血脑屏障通透性之后，激活了PI3K/AKT信号转导通路，介导Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白表达降低，通过调节二者比值实现，姜黄素的脑保护效果与剂量相关。

姜黄素；PI3K/AKT信号通路；Bcl-2；Bax

脑缺血再灌注损伤中最常出现的是细胞凋亡。在众多细胞凋亡机制涉及的信号转导通路中，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号转导通路是最为重要的，其发挥抑制细胞凋亡作用的机制可通过调控凋亡蛋白和基因的表达来实现〔1〕。神经营养因子能够激活PI3K/AKT信号转导通路，但是它作为大分子，通过血脑屏障很难。姜黄素是一种脂溶性酚类色素，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗细胞凋亡等药理作用，可以阻止神经元损伤，对神经变性病变具有保护作用；可以改善外周神经病、脑损伤等多种疾病症状〔2〕。但姜黄素对PI3K/AKT信号通路的影响却鲜有报道。本研究观察姜黄素对脑缺血模型大鼠脑组织中的PI3K、AKT、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)等凋亡密切相关蛋白的表达变化，大鼠脑组织含水量和血脑屏障通透性的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂 成年雄性清洁级SD大鼠72只，体质量(250±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。姜黄素，购自上海鼎瑞贸易有限公司。PI3K、AKT兔抗大鼠多克隆免疫组化试剂盒，购自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗人Bcl-2、Bax多抗，购自上海延生实业有限公司；其他试剂皆为国产分析纯。

1.2动物分组和处理 大鼠称重编号后用随机数字表法分组：假手术组、模型组、低、剂量姜黄素组、高剂量姜黄素组，各18只。35 mg/kg水合氯醛麻醉后，参照文献〔3〕方法造模，模型组、低、高剂量姜黄素组、脑缺血大鼠模型的制备采用将大鼠两侧颈动脉结扎的方法进行，假手术组仅仅裸露颈总动脉、神经。用二甲基亚砜(DMSO)将姜黄素纯品配制成终浓度为50 mg/L的母液，过滤除菌后于-20℃避光存储，每次用前将培养液稀释至所需浓度。在造模后第28天起，低、高剂量姜黄素组予200、300 mg·kg-1·d-1灌胃给药，连续干预35 d；假手术组及模型组给予生理盐水。

1.3PI3K、AKT蛋白表达检测 在最后给药的12 h之后，按随机方法在每组中选出6只大鼠，以乙醚麻醉断头处理，选取视交叉至漏斗部之间的脑组织，10%CH3CHO置于4℃冰箱固定48 h，石蜡包埋，冠状切片5 μm厚，常规脱蜡、酒精浸水，以柠檬酸盐缓冲液微波法进行抗原修复，水洗后分别滴加兔抗大鼠PI3K(1∶150)、AKT(1∶100)多抗，于4℃下静置12 h，孵育液30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色之后苏木精复染，常规脱水、透明、封片。阳性细胞吸光度的检测：MiVnt图形采集分析系统、取平均值、利用PBS作阴性对照。

1.4凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax的检测 按照SABC步骤染片，将48 h的脑组织切片脱蜡至水，严格按照试剂盒说明书操作进行，高倍镜下观察胞质着色呈棕黄色的为阳性细胞。

1.5脑组织含水量检测 各组随机取6只大鼠断头、取脑，去除嗅球部分，称湿重后于90℃干燥箱干燥24 h，再称重，计算脑组织含水量。

1.6血脑屏障通透性检测 每组遗留的6只大鼠，2%伊文思蓝于大鼠的尾部静脉注射，3 h后以水合氯醛麻醉，0.2 L生理盐水于大鼠左心室注射来冲洗血管内血液，取脑称量，脑组织放于甲酰胺内，于60℃下水浴24 h，匀浆后离心(1 000 r/min，6 min)，635 nm波长处检测上清液的OD值，以此计算伊文思蓝含量。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行LSD检验，Games-Howell检验。

2 结 果

2.1各组PI3K蛋白、AKT蛋白阳性表达比较 PI3K蛋白、AKT蛋白阳性表达为棕黄色模型组较假手术组PI3K、AKT明显升高(P<0.05) ；与模型组比较，低、高剂量姜黄素组PI3K、AKT蛋白均明显增加(P<0.05)，见表1。

表1 各组PI3K、AKT蛋白阳性表达、含水量及伊文思蓝含量、Bcl-2、Bax蛋白表达比较

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

2.2各组脑组织含水量比较 模型组较假手术组脑组织水含量明显增加(19.93±4.69)%(P<0.05)；低、高剂量姜黄素组较模型组脑组织水含量分别下降了(13.99±1.98)%和(12.99±1.97)%(P<0.05)，见表1。

2.3各组血脑屏障通透性比较 模型组较假手术组伊文思蓝显著增加(596.39±129.79)%(P<0.05)；与模型组比较，低、高剂量姜黄素组伊文思蓝各自降低了(42.97±7.92)%和(39.85±7.93)%(P<0.05)，见表1。

2.4Bcl-2、Bax蛋白表达变化 在梗死灶周围皮质或纹状体内可见Bcl-2阳性细胞，假手术组只可呈现Bcl-2、Bax少量反应。缺血周边区，模型组及姜黄素组Bcl-2、Bax蛋白表达皆较假手术组升高(P<0.05)。姜黄素组Bcl-2表达明显高于模型组(P<0.05)，Bax表达明显少于模型组(P<0.05)，见表1。

3 讨 论

有效地抑制或减少细胞凋亡是实现脑保护作用的重要手段。PI3K/AKT信号转导通路作为细胞生存的信号通路之一，其在细胞增殖、分化、抑制神经细胞凋亡方面起重要作用〔4〕。脑缺血后，机体本身可以释放出一些能够将具有酪氨酸激酶活性受体激活的物质，如神经细胞生长因子、整合素等，受体经过其磷酸化以后会特异性地结合PI3K的调节亚基，从而将PI3K激活；同时兼备脂类激酶活性与蛋白激酶活性的PI3K激活后可以使细胞膜上的肌醇发生磷酸化，生成第二信使。PI3K结合其下游的效应分子AKT的PH结构域，AKT从细胞质向细胞膜转位，构象改变，Thr308位点及Ser473位点发生磷酸化，由抑制状态变为激活状态。AKT活性的最终实现需要依赖Ser473的磷酸化，AKT磷酸化激活后即成为p-AKT。p-AKT通过直接将其下游凋亡靶蛋白磷酸化或者间接改变、编码凋亡相关蛋白的基因表达水平来实现脑保护作用〔5，6〕。总之，PI3K/AKT信号通路激活后，能够作用于Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB等下游凋亡靶蛋白，通过激活或抑制表达来发挥生物学效应。本实验与吕俊杰等〔7〕结论一致，提示缺血再灌注损伤中，姜黄素发挥的保护效果必然与PI3K/AKT信号通路的激活密不可分。

血脑屏障通透性破坏引发的脑水肿对于神经细胞损伤和凋亡发挥着促进作用，使细胞功能障碍和坏死现象加重，因此两者经常被选为衡量缺血性脑病治疗效果的指标〔8〕。Bcl-2/Bax值直接影响细胞凋亡状态，Bcl-2/Bax值越大，则对凋亡抑制作用越明显，反之，则促进凋亡。二者发挥作用的方式都是经过上游生物学信号激活之后，通过对相关下游基因的激活来完成的，其中PI3K/AKT信号通路便可激活二者，调节两者之间的比值变化〔9，10〕。本实验中姜黄素给药后，两者比值发生显著变化，提示由PI3K/Akt信号通路激活所引发Bcl-2/Bax值变化。本文结果显示姜黄素能够降低BBB通透性，激活PI3K/AKT信号转导通路，通过介导Bcl-2、Bax发生相应变化，即调节二者比值实现减轻脑水肿、抑制细胞凋亡的生物学效应。然而PI3K/AKT信号通路激活后可以介导多种凋亡因子，本文仅研究了凋亡因子Bcl-2、Bax，姜黄素激活PI3K/AKT信号通路后是否也能介导其他凋亡因子发生改变尚不明确；姜黄素的疗效与其给药剂量密切相关，何种剂量能够发挥其最佳疗效尚需研究；同时，信号转导通路众多，其是否能够激活其他重要的通路仍然不得而知。

1谢 飞，魏 珂，闵 苏，等.神经生长因子对H9c2心肌细胞缺氧/复氧后凋亡的保护作用及其机制〔J〕.中国药理学通报，2014；4(17)：506-10.

2李 勇，王蓬文.姜黄素神经保护作用研究概况〔J〕.中国中药杂志，2009；24(9)：3173-5.

3Chang L，Graham PH，Hao J，etal.Acquisition of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell phenotypes is associated with activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway in prostate cancer radioresistance〔J〕.Cell Death Dis，2013；4(7)：391-7.

4张蔺珊，李娟娟，吴春云.脑缺血的损伤机制及相关信号通路的研究进展〔J〕.神经解剖学杂志，2014；6(25)：729-32.

5郁 迪，莫绪明.PI3K/Akt和MAPK信号通路在缺血性脑损伤中的保护作用〔J〕.医学综述，2015；2(19)：210-3.

6黄雄峰，汪建民.葛根素的神经保护作用机制研究进展〔J〕.中国实验方剂学杂志，2015；4(13)：224-30.

7吕俊杰，武雅琴，蒋 峰，等.姜黄素对大鼠肺缺血再灌注损伤肺泡Ⅱ型细胞的保护作用〔J〕.中华实验外科杂志，2013；30(5)：992-4.

8郑立霞，徐鑫淼，郎现波，等.胍丁胺对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的作用机制研究〔J〕.中国临床药理学杂志，2015；7(14)：544-7.

9马 娜，郭瑞珍，阮 媛，等.PI3K-AKT-Bcl-2抗凋亡途径与瘢痕癌癌细胞凋亡相关性探讨〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2014；8(16)：〗

10韩 军，宣佳利，胡浩然，等.金丝桃苷预处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤作用与PI3K/Akt信号通路的关系〔J〕.中国中药杂志，2015；1(5)：118-23.

〔2016-06-19修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R285

A

1005-9202(2017)19-4756-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.028

1 华北石油总医院普外科

吴晓光(1975-)，男，硕士，主要从事脑缺血损伤机制及药物干预研究。

仇志富(1988-)，男，硕士在读，主要从事脑病损伤机制及药物干预研究。