白彝华 杨 敏 蒋红樱 王剑松 王家平

(昆明医科大学第二附属医院肾内科，云南 昆明 650101)

小剂量IL-17A对糖尿病肾病大鼠肾功能的保护作用

白彝华 杨 敏 蒋红樱 王剑松1王家平2

(昆明医科大学第二附属医院肾内科，云南 昆明 650101)

目的探讨小剂量白细胞介素(IL)-17A对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。方法雄性SD大鼠45只，随机分为正常对照组、糖尿病肾病(DN)组及IL-17A组。DN组及IL-17A组均以高脂高糖饮食联合腹腔注射链脲佐菌素建立DN大鼠模型。IL-17A组给予小剂量IL-17A重组蛋白，连续给药12 w后，下腔静脉取血，检测糖化血红蛋白(HbA1c)、肌酐、尿素氮等；水平代谢笼收集各组大鼠24 h尿液，测定大鼠24 h尿蛋白；实时荧光定量PCR检测肾组织炎症因子表达；Western印迹测定IL-17A蛋白表达情况。结果DN组及IL-17A组尿蛋白、HbA1c、肌酐、尿素氮水平均显著高于正常对照组，IL-17A组均显著低于DN组(均P<0.05)。DN组在注射IL-17A后促炎因子表达显著减少，抑制性炎症因子表达显著降低。DN模型大鼠IL-17A蛋白显著减少。结论IL-17A具有改善DN大鼠肾功能作用，并有可能逆转DN，是治疗DN的有效靶点。

糖尿病肾病；白细胞介素17A；炎症反应

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是全球范围内导致终末期肾病的主要病因〔1〕。目前关于肾小管间质病变机制的作用逐步得到关注〔2〕。大量研究显示，炎症反应在糖尿病慢性肾病进程中扮演重要角色，其严重程度部分取决于各种白细胞介素(IL)家族因子间的相互作用，既可以介导炎症反应又可以调节炎症反应〔3～5〕。IL-17A是由CD4+T细胞、自然杀伤细胞及中性粒细胞产生，具有调节和募集中性粒细胞的作用。近来研究显示IL-17A在银屑病、动脉粥样硬化、强直性脊柱炎等疾病中可通过抑制炎症反应而发挥积极作用〔6，7〕。但目前关于IL-17A在DN进展中发挥怎样的作用尚无相关报道。本实验拟研究IL-17A对DN大鼠肾脏的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 清洁级雄性D大鼠45只，体重160～190 g，平均(175.1±6.9)g，8周龄，由维通利华动物技术公司提供，大鼠饲养和实验严格要求进行，自由进食水，光照周期12 h。链脲佐菌素(STZ)为Sigma公司，IL-17A重组蛋白为Biovision公司，抗GAPDH、抗IL-17A抗体为Abcam公司，CFX96型荧光定量基因扩增仪(Bio-Rad)，ND 2000C型紫外分光光度计(Thermo Scientific)，BS-380型生化分析仪(迈瑞)。

1.2实验分组与建立DN模型 45只雄性SD大鼠适应性饲养1 w后随机分为正常对照组、DN组及IL-17A组。IL-17A组及DN组给予高脂高糖饮食1个月诱导胰岛素抵抗，后采用腹腔一次性注射STZ溶液(150 mg/kg)建模。正常对照组给予等量枸橼酸缓冲液。注射后1 w检测大鼠空腹血糖，血糖高于11.2 mmol/L即建模成功。该模型具有高血脂、胰岛素抵抗和典型DN等特点。

1.3IL-17A给药 STZ注射后1 w，模型制作成功后，治疗组给予腹腔注射IL-17A重组蛋白(10 ng/次，48 h/次)，连续注射12 w；正常对照组和DN组给予注射等量磷酸盐缓冲液(PBS)。

1.4标本采集 药物注射12 w后，将大鼠放入水平代谢笼中收集各组大鼠24 h尿液，酶联免疫吸附(ELISA)法测24 h尿微量蛋白；心脏取血后处死大鼠，测定血中糖化血红蛋白(HbA1c)、肌酐、尿素氮；取出肾脏立即放入液氮中，置于-80℃冰箱冻存留做检测。

1.5RT-PCR 应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法测定大鼠肾组织中炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6的表达情况。Trizol 法提取组织总RNA。引物序列IL-6上游：5′-ACA ACC ACG GCC TTC CCT ACT T-3′,下游：5′-CAC GATTTC CCA GAG AAC ATG TG-3′;TNF-α上游：5′-AAG CCT GTA GCC CAC GTC GTA-3′,下游：5′-GGC ACC ACT AGT TGG TTG TCT TTG-3′;IL-10上游：5′-GCT CTTA CTG ACT GGC ATG AG-3′,下游：5′-CGC AGC TCT AGG AGC ATG TG-3′;GAPDH上游：5′-GTG TAA CCC ATA ACC CCC AAG A-3′,下游：5′-CAC CAG CAG ACC CTC AAG C-3′。逆转录法按照M-MLV试剂盒(Invitrogen)操作程序进行。扩增反应体系10 μl，反应条件为预变性：94℃，2 min；变性：94℃，10 s；退火：60℃，20 s；延伸：72℃，15 s，进行39个循环，循环结束后72℃ 10 min总延伸。选择管家基因GAPDH作为内标，对目的基因均一化。目的基因相对表达量采用2-ΔΔCT法，将正常对照组标本内目的基因表达水平设为1，对DN组及IL1-7A组标本内目的基因表达水平进行标准化。

1.6Westem印迹法 称取100 mg -80℃保存的肾组织加入适量PBS，加入适量组织蛋白裂解液，用超声波细胞破碎仪裂解组织后，每10 min漩涡振荡器振荡1次；10 000 r/min离心30 min，取上清液，用BCA法测定蛋白浓度。定量后各取样本量30 μg，10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，电压100 V，电泳2 h。湿式转膜法将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，电压80 V，时间 1 h。用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h。4℃冰箱内孵育一抗(1∶3 000)过夜；TBST洗膜后室温下二抗(1∶5 000) 孵育1 h，TBST洗膜后与ECL发光试剂反应，于凝胶成像分析仪上进行检测。通过Image J软件计算各条带灰度值，以GAPDH作为内参进行标准对照。

1.7统计学分析 用SPSS17.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 STZ注射后5 d，3只大鼠可能因血糖过高致死。至实验结束共存活大鼠42只，正常对照组15只，IL-17A组14只，DN组13只。正常对照组大鼠精神好，毛发光泽，食欲佳，体重持续增加；IL-17A组精神一般，毛发光泽度差，食欲可，体重增加；DN组精神差，毛色无光泽，明显出现多饮、多食、多尿表现，行动迟缓。

2.2各组大鼠尿蛋白、HbA1c、肌酐、尿素氮水平对比 与正常对照组比较，DN组及IL-17A组尿蛋白、HbA1c、肌酐、尿素氮水平均显著升高(P<0.05)；与DN组比较，IL-17A组尿蛋白、肌酐、尿素氮水平均显著降低(P<0.05)，HbA1c水平有所下降，但无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠相关指标水平比较

与正常对照组比较：1)P<0.05；与DN组比较：2)P<0.05

2.3大鼠肾脏炎症因子的表达 与正常对照组(1.2±0.8，1.2±0.8，0.77±0.24)比较，DN组(15.1±1.2，17.0±1.4)和IL-17A组(8.2±1.0，6.3±0.8)IL-6、 TNF-α表达显著升高，DN组IL-10显著降低(0.41±0.06)，IL-17A组IL-10显著升高(1.42±0.31，均P<0.05)；与DN组比较，IL-17A组IL-6、 TNF-α表达显著降低，IL-10显著升高(均P<0.05)。

2.4大鼠肾脏IL-17A蛋白表达情况 与正常对照组(0.52±0.09)相比，DN组IL-17A蛋白(0.23±0.06)显著降低，IL-17A组显著升高(0.72±0.04，P<0.05)；与DN组比较IL-17A组IL-17A蛋白显著升高(P<0.05)，见图1。

图1 各组大鼠肾脏IL-17A蛋白的表达

3 讨 论

20%～40%2型糖尿病患者会并发DN〔8〕。DN是糖尿病患者严重的微血管并发症之一，是致残、致命性的并发症，可导致患者慢性肾功能不全。早期、晚期患者均可出现蛋白尿，严重者可出现尿毒症。病变肾脏组织病理特点表现为肾小管和肾小球的基底膜增厚，细胞外基质积聚增多以及连续性的系膜增生〔9〕。依靠严格的胰岛素治疗，严格控制患者饮食中蛋白质的摄入量，采取低蛋白饮食，控制血压等措施可以延缓DN的发生。

自Bohle等〔10〕发现DN患者肾组织中存在巨噬细胞浸润后，越来越多的证据显示，炎症在DN发展进程中发挥重要作用。Navarro等〔11〕发现Ⅱ型糖尿病患者血清中TNF-α水平显著高于正常人群，是DN临床的独立相关性标志物。另外炎症因子单核细胞趋化因子-1〔12〕、细胞间黏附分子-1〔13〕、IL-6〔14〕等均证明与DN的发生与发展有关。

IL-17家族蛋白已被证实在关节炎等炎性、纤维化疾病中发挥负性调控炎症因子作用〔15〕。IL-17家族细胞因子能诱导多种细胞因子表达，如IL-6、IL-1、TGF-β、TNF-β、TNF-α及趋化因子IL-8、MCP-1等。通过这些细胞因子及趋化因子，IL-17在治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、移植排斥反应及牛皮癣等发挥一定的作用。IL-17家族各成员有不同的表达部位和方式，T细胞激活后分泌IL-17A、IL-17F，并在炎症反应期间有显著的上调；IL-17B表达于外周组织和免疫器官；IL-17C在炎症反应期间表达会有上调，但在一般情况下呈低表达状态；IL-17D在神经系统和骨骼肌中高表达，IL-17F在多种外周组织中都成低表达状态〔16〕。IL-17A的作用是把双刃剑，一方面可以抑制动脉粥样硬化的发生〔17〕，另一方面在载脂蛋白E敲除小鼠中IL-17A缺乏又会加速不稳定动脉粥样斑块的形成〔18〕。而关于IL-17A在肾脏病中的作用目前尚不明确。

本研究结果说明DN大鼠肾组织中IL-17A蛋白减少，炎症反应加剧，通过注射IL-17A重组蛋白，炎症减轻，肾功能得到改善。

Tong等〔19〕研究发现与野生型糖尿病模型小鼠相比，IL-17A基因敲除糖尿病模型小鼠的蛋白尿程度以及肾间质的损害相对较轻，说明抑制IL-17的表达将改善DN的症状，甚至可能实现DN的转归。目前，有一种新兴药物IL-17A抑制剂，即Secukinumab，它是一种重组、高亲和性、人免疫球蛋白G1κ单克隆抗体，能够选择性地与IL-17A结合从而中和IL-17A的作用，目前处于Ⅲ期临床试验阶段。Ⅱ期临床试验结果显示其对银屑病、强直性脊柱炎、类风湿关节炎有明显疗效〔20〕。而目前关于抑制IL-17A或IL-17F对于DN的作用还无相关报道。

本研究结果表明，IL-17A的缺乏会促进肾病的进展，加剧糖尿病模型大鼠的病情；但是给予糖尿病模型大鼠低剂量的IL-17A，能够有效治疗大鼠DN模型的肾脏炎症反应，并有可能预防和逆转DN，从而成为治疗DN的有效靶点。

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〔2017-03-11修回〕

(编辑 李相军)

R587.1

A

1005-9202(2017)19-4729-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.017

云南省科技厅-昆明医科大学联合专项基础研究基金(No.2015FB054)

1 昆明医科大学第二附属医院泌尿外科 2 昆明医科大学第二附属医院放射科

杨 敏(1971-)，女，副主任医师，主要从事急、慢性肾脏病研究。

白彝华(1981-)，女，博士，主治医师，主要从事急、慢性肾脏病研究。