韩 冰 赵国军 兰素伟 付子毅

(承德医学院附属医院妇科，河北 承德 067000)

S6K1沉默对宫颈癌细胞侵袭迁移及相关基因表达的影响

韩 冰 赵国军 兰素伟 付子毅1

(承德医学院附属医院妇科，河北 承德 067000)

目的探讨RNA干扰核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)对人宫颈癌细胞Hela侵袭迁移及相关基因表达的影响。方法根据文献报道及siRNA设计原则合成靶向S6K1基因的siRNA，以阳离子脂质体Lipofectamine 2000为载体转染对数生长期Hela细胞(沉默组)，同时设转染不针对任何基因随机序列的阴性对照组和转染试剂的空白对照组。转染48 h后采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测干扰效率，分别于转染24、48、72 h后采用WST法评价靶向沉默S6K1对Hela细胞增殖的影响，采用Transwell小室法检测经S6K1沉默后对Hela细胞侵袭迁移的影响，采用Western印迹法检测S6K1沉默后Hela细胞中人基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1、TIMP-2的蛋白水平。结果以空白对照组为参照(其S6K1 mRNA水平为1.000)，阴性对照组的S6K1 mRNA水平为(1.027±0.034)，差异无统计学意义(P>0.05)，而沉默组的S6K1 mRNA水平(0.158±0.012)低于其余两组(P<0.05)，相对于空白对照组的沉默率为(92.4±3.7)%。与空白对照组和阴性对照组比较，沉默组转染后的增殖率降低，迁移实验和侵袭实验中的穿膜细胞数均降低，MMP-2、MMP-9蛋白水平均降低，而TIMP-1、TIMP-2蛋白水平均升高(P<0.05)。结论RNA靶向沉默S6K1表达可抑制人宫颈癌Hela细胞侵袭迁移，可能与其抑制MMP-2/9表达及促进TIMP-1/2表达有关。

核糖体蛋白S6激酶1；宫颈癌；侵袭；迁移

尽管目前拥有手术及放化疗等有效治疗手段，但宫颈癌的致死率仍较高，而肿瘤细胞发生侵袭转移是其治疗失败的主要原因〔1〕。恶性肿瘤的发生发展涉及多个基因的状态异常〔2〕。核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)参与了一系列重要的代谢反应，包括蛋白质、核苷酸及脂质的合成〔3,4〕，作为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路关键的下游效应因子，调节细胞的生长与代谢〔5〕。近年来发现S6K1参与了恶性肿瘤的发生发展，在调节癌细胞增殖凋亡等过程中发挥重要作用〔6,7〕，但其在宫颈癌中的表达模式及作用尚不清楚。本研究采用siRNA手段沉默S6K1表达，分析对宫颈癌细胞迁移侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1细胞株与试剂 人宫颈癌Hela细胞购于中国科学院上海细胞库，WST细胞增殖毒性分析试剂盒(WST-1cell proliferation assay kit)购于中国碧云天生物技术有限公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程公司，PrimeScript®RT reagent kit、SYBR®Premix ExTaq kit购自大连宝生物工程有限公司，Trizol试剂、逆转录试剂盒、Lipofectamine 2000转染试剂及Opti-MEM培养基购自上海Invitrogen公司，RPMI 1640培养基购自HyClone公司，Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel胶购自美国 Becton Dickinson Labware公司，抗人基质金属蛋白酶(MMP)2(ab37150)、MMP9(ab38898)一抗均购自美国 Abcam公司，基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1、TIMP-2一抗均购自美国 SANTA CRUZ公司。

1.2细胞培养 将Hela细胞常规培养于含10% FBS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，将细胞培养箱的参数设置为37℃、CO2的体积分数为5%，48 h后半量换液，弃去悬浮细胞(未贴壁或已死亡)，以后每2～3 d换液1次继续培养，待达80%～90%融合后，胰酶消化传代按1∶3行传代培养。

1.3siRNA引物设计及转染 根据文献报道〔9〕及siRNA设计原则合成设计1条靶向S6K1基因的siRNA，同时设计不针对任何基因的随机序列(siRNA-NC)，以上序列均由上海生工生物工程公司合成。S6K1：5′-CAGUGGAGGAGAACUAUUUdTdT-3′，siRNA-NC：5′-CCUACGCCACCAAUUUCGUdTdT-3′。

1.4siRNA转染 取对数生长期Hela细胞以2×105个/ml的浓度接种于6孔板进行转染，经预实验发现当siRNA与Lipofectamine 2000的体积比为1∶1时有较佳的转染效率，取50 μl含100 pmol siRNA的Opti-MEM培养基与50 μl 含Lipofectamine 2000的Opti-MEM培养基混合5 min以形成siRNA-Lipo2000混和物，随后加入2 ml接种Hela细胞的无FBS的RPMI 1640培养基，4 h后替换为含血清的培养基。根据siRNA片段转染情况将Hela细胞分为沉默组(转染靶向S6K1 siRNA)和阴性对照组(转染siRNA-NC)，同时设仅行转染试剂Lipofectamine 2000处理的空白对照组。转染48 h后采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测S6K1的沉默率。

1.5实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测Hela细胞中S6K1 mRNA水平 采用Trizol试剂提取Hela细胞中的总RNA，取2 μg总RNA采用PrimeScript®RT reagent kit制备cDNA，采用SYBR®Premix ExTaq kit进行RT-PCR扩增，条件：95℃变性5 min，(95℃ 30 s、55℃ 30 s及72℃ 30 s)共30个循环，72℃延伸10 min。采用2-△△Ct进行相对定量分析，计算S6K1相对于内参β-actin的相对表达量。S6K1上游引物：5′-CTCATCCTTGAGTATCTCAG-3′，下游引物：5′-TGCTCCCAAA CTCCACCAAT-3′；β-actin上游引物：5′-AGCGGGAAATCGTG CGTGAC-3′，下游引物：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3′。

1.6WST法检测细胞增殖 取转染后的Hela细胞，以每孔2×103个接种于96孔板，每组设3个复孔，分别于转染24、48、72、96 h后吸弃培养上清液，向每孔加入100 μl 含10% WST-1的RPMI 1640培养基，孵育3 h后，采用EXL-800型酶标仪检测450 nm波长下的吸光度值(A)并计算沉默组或阴性对照组相对于空白对照组的活力变化。

1.7Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力

1.7.1迁移实验 转染24、48 h后收集各组细胞，无血清RPMI 1640培养液重悬后，加入小室上室，下室加入含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液，常规于细胞培养箱中培养，24 h后取出小室，用棉签拭去膜上室面细胞，70%甲醇室温固定15 min，结晶紫染色10～15 min，在100倍倒置显微镜下计数细胞数。

1.7.2侵袭实验 接种细胞前先铺Matrigel胶，按50 μl/孔均匀铺于小室上室的聚碳酸酯膜上，待胶铺匀后，水平置入37℃细胞培养箱中，孵育1～2 h后变为固态。用无血清RMPI 1640培养液清洗1次，按照产品说明书进行水化，备用。其余步骤同迁移实验，在100倍倒置显微镜下计数细胞数。

1.8Western印迹方法 按照常规Western印迹方法检测各组细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白水平，以β-actin为内参，计算以上蛋白相对于内参的表达情况。

1.9统计学处理 采用SPSS18.0软件行单因素方差分析(one way ANOVA)，两两比较采用SNK法。

2 结 果

2.1转染效率 以空白对照组为参照(其S6K1 mRNA水平为1.000)，阴性对照组的S6K1 mRNA水平为(1.027±0.034)，差异无统计学意义(P>0.05)，沉默组的S6K1 mRNA水平(0.158±0.012)低于其余两组(P<0.05)，相对于空白对照组的沉默率为(92.4±3.7)%，提示在Hela细胞中采用siRNA靶向沉默S6K1成功。

2.2siRNA靶向沉默S6K1对Hela细胞活性的影响 与空白对照组和阴性对照组比较，沉默组转染24～96 h后的增殖率降低，呈时间依赖，其中96 h的增殖率低于50%，以上差异均有统计学意义(P<0.05)；空白对照组和阴性对照组以上时间点增殖率的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 siRNA靶向沉默S6K1对细胞活力的影响

与空白对照组比较：1)P<0.05；与阴性对照组比较：2)P<0.05，下表同

2.3siRNA靶向沉默S6K1对细胞迁移能力的影响 与空白对照组和阴性对照组相比，沉默组转染24、48 h的穿膜数目均减少(P<0.05)；沉默组相对于空白对照组的24、48 h迁移能力抑制率均在40%以上。空白对照组和阴性对照组细胞穿膜数目的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 siRNA靶向沉默S6K1对细胞迁移能力的影响

2.4siRNA靶向沉默S6K1对细胞侵袭能力的影响 与空白对照组和阴性对照组相比，沉默组转染24、48 h的穿膜数目减少(P<0.05)；沉默组相对于空白对照组的24、48 h侵袭能力抑制率均在50%以上。空白对照组和阴性对照组细胞穿膜数目的差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 siRNA靶向沉默S6K1对细胞侵袭能力的影响

2.5siRNA靶向沉默S6K1对侵袭能力相关基因的影响 与空白对照组和阴性对照组相比，沉默组的MMP-2和MMP-9蛋白水平均降低，分别为对照组的0.379和0.227倍；而TIMP-1和TIMP-2蛋白水平均升高，分别为对照组的3.467和2.200倍(P<0.05)；空白对照组和阴性对照组MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 siRNA靶向沉默S6K1对细胞侵袭能力相关基因的影响

3 讨 论

S6K1是mTOR复合体的下游效应器，可调节细胞的多项基本功能，如存活、增殖、代谢、迁移和血管生成〔5～8〕。在多种乳腺癌细胞中发现S6K1基因表达增多，且与乳腺癌患者的不良预后有关〔9〕。抑制S6K1表达可增强Bcl-2/Bcl-xL活性缺失诱导乳腺癌细胞凋亡〔10〕。此外，S6K1还参与了EGFR野生型NSCLC细胞对厄洛替尼的敏感性调节〔11〕。以上结果提示S6K1在恶性肿瘤发生发展中发挥癌基因的作用。

本研究根据文献报道〔8〕并参考siRNA设计策略构建了靶向S6K1的siRNA，在高效转染后发现Hela细胞中S6K1 mRNA水平大幅降低，提示靶向干扰效果较好，为下一步研究S6K1与宫颈癌细胞侵袭迁移的关系提供了方法学基础。细胞的增殖过程受严格调控，而肿瘤细胞增殖调节异常，如何控制癌细胞过度增殖也是宫颈癌防治的重点〔10〕。本研究发现采用siRNA下调S6K1表达后，Hela细胞的增殖受到抑制，明确表明S6K1参与了宫颈癌细胞增殖的调控过程。Ras/MAPK和PI3K/Akt信号通路参与了mTOR功能的调节〔12〕，该两条通路在多种肿瘤中处于激活状态，也是导致肿瘤细胞增殖失控的主要原因之一。S6K1为mTOR的下游效应分子，通过siRNA转染手段沉默S6K1表达，可能会影响以上信号通路的活性，故推测沉默S6K1表达可能会通过抑制Ras/MAPK/mTOR和PI3K/Akt/mTOR信号通路的活动发挥抑制Hela细胞增殖的效果。本研究的不足之处为未在动物模型上检测。侵袭转移是宫颈癌治疗失败和复发的主要原因之一。本研究发现靶向沉默S6K1表达后，Hela细胞的侵袭和迁移细胞数目均降低，且迁移能力和侵袭能力均受抑制，表明S6K1可成为预防Hela细胞侵袭迁移的重要靶点。细胞基底膜和细胞外基质完整性与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关，受到MMP与TIMP家族的调节〔13，14〕。本研究进一步分析提示S6K1参与了宫颈癌细胞MMP/TIMP系统的调节，抑制S6K1表达可提高TIMP活性以促进其对MMP系统的对抗，最终达到抑制侵袭迁移的目的。

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14Kwiatkowska E,Domanski L,Bober J,etal.Urinary metalloproteinases-9 and-2 and their inhibitors TIMP-1 and TIMP-2 are markers of early and long-term graft function after renal transplantation〔J〕.Kidney Blood Press Res,2016;41(3):288-97.

〔2017-02-17修回〕

(编辑 徐 杰)

R739

A

1005-9202(2017)19-4726-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.016

国家自然科学基金(81302304)

1 南京医科大学附属南京市妇幼保健院医学研究中心

韩 冰(1976-)，女，主治医师，主要从事妇科研究。