彭建萍 陈乐蓉 胡欣春 程小鹏 廖连芳 吴亮亮

(江西省胸科医院呼吸科，江西 南昌 330006)

1，25(OH)2D3对PM2.5在体染毒慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症的作用

彭建萍 陈乐蓉 胡欣春 程小鹏 廖连芳 吴亮亮

(江西省胸科医院呼吸科，江西 南昌 330006)

目的探讨1,25二羟维生素D3〔1，25(OH)2D3〕对PM2.5在体染毒慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠气道炎症的作用。方法72只雄性Wistar大鼠随机分成正常组、COPD组、1，25(OH)2D3+COPD组(合并组),每组24只，对三组大鼠气管滴注PM2.5染毒，每天染毒1次，连续3 d，在最后一次染毒24 h后处死动物，分析肺泡灌洗液中白细胞介素(IL)-8、IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量。结果PM2.5对正常组、COPD组、合并组大鼠均产生急性毒性，且存在剂量反应关系，COPD组肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α浓度明显高于正常组(P<0.05)，经1,25(OH)2D3干预COPD组IL-8、TNF-α浓度低于COPD组，但仍高于正常组(P<0.05)。结论COPD大鼠比正常大鼠对PM2.5更加易感，PM2.5可加重COPD的气道炎症。1,25(OH)2D3可减轻COPD气道炎症及损伤，在PM2.5染毒情况下补充1,25(OH)2D3对COPD的气道炎症仍具有改善作用。

大气细颗粒物(PM2.5)；慢性阻塞性肺疾病；1，25二羟维生素D3；炎症

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种气道慢性炎症性疾病，与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关〔1〕。气道炎症是COPD主要的病理特征，该炎症涉及中性粒细胞、巨噬细胞和CD8+T细胞等炎症细胞，产生多种细胞因子和炎症介质，如白细胞介素-(IL)-8、IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)-α等，导致白细胞黏附、移行到炎症部位参与炎症反应，引起气道过量黏液分泌，纤维化和蛋白水解，致使COPD临床症状反复加重〔2〕。由于大气PM2.5表面积相对较大，可吸附大量有毒物质，同时PM2.5体积小，使其通过呼吸沉积肺泡，加重COPD的气道炎症，并引起免疫反应延迟，使气道对细菌的易感性增加，导致COPD反复加重，肺功能进行性下降。研究发现1，25(OH)2D3在慢性气道炎症及自身免疫性疾病的免疫应答方面均发挥着复杂的调控作用〔3,4〕。Hansdottir等〔4〕研究显示1，25(OH)2D3可以通过核转录因子-κB信号通路来减少IL-8的产生。本研究拟分析PM2.5对COPD气道炎症的影响及1，25(OH)2D3对COPD气道炎症的调控作用。

1 材料与方法

1.1材料 颗粒物采样器：TSP/PM10/PM2.5 2型(北京地质仪器厂和北京迪克机电技术有限公司)，低温真空冷冻干燥机：MCFD5505型(美国sim公司)，超声振荡器：KQ-50B型(昆山市超声仪器有限公司)，低温高速离心机：TGL-16G型(上海安亭科学仪器公司)，人IL-8酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(深圳晶美生物技术公司)，人IL-17 ELISA试剂盒(深圳晶美生物技术公司)，人TNF-α ELISA试剂盒(深圳晶美生物技术公司)，美国BIOKIT公司产ELX-800型酶标仪，-80℃超低温冰箱(MDF-U52V;SANYO;Japan)。

1.2PM2.5的采样与处理 在江西省胸科医院门诊大楼10层(高约30 m)设置采样点，采样时间为2014年1～3月，采用90 mm玻璃纤维滤膜采集PM2.5样品。每天24 h连续采样，连续采集2个月。遇到极端天气(如雨、雪等)时停止采样。将载有PM2.5的滤膜浸入蒸馏水中，在超声振荡器上反复振荡，多层无菌纱布过滤后滤液用低温离心机4℃、10 000 r/min离心20 min。吸取上清液继续用于超声振荡，收集底层颗粒物，最后将浓缩的上清液及所有收集的底层颗粒物合并真空冷冻干燥，低温冰箱保存，以灭菌三蒸水配成3种浓度的颗粒物悬液后超声震荡15 min混匀，4℃保存，临用前振荡5 min使颗粒物充分混匀。

1.3动物分组及模型制备 正常成年雄性Wistar大鼠72只，由南昌大学实验动物中心提供，体重180～250 g。大鼠在正常饲料饲养1 w后进行实验，所有大鼠随机分成三组，每组24只，(1)正常组：不经任何处理；(2)COPD组：大鼠第1、14天经气管内注入1 g/L的内毒素(美国Sigma公司)，第2～30天(第14天除外)将大鼠置入自制有机玻璃仓内，暴露于烟雾，每天上午同时点燃14支香烟，1 h/d，饲养6 w；(3) 1,25(OH)2D3+COPD组(合并组)：大鼠在COPD组基础上同时给予1，25(OH)2D3口服制剂1 μg/d灌胃，饲养6 w。

1.4试验动物染毒及支气管肺泡灌洗

1.4.1COPD模型建立的确定和生理盐水对照组的支气管肺泡灌洗 随机从三组各抽取6只大鼠作为生理盐水对照组并确定COPD模型，采用气管滴注37℃无菌生理盐水的方法，气管滴注量为1.5 ml/kg体重(bw)，每天滴注1次，连续3 d，在最后一次滴注24 h后取左肺缓慢注入37℃无菌生理盐水3 ml进行支气管肺泡灌洗，取灌洗液细胞计数分类；腹主动脉放血处死大鼠，切取大鼠右侧肺组织行病理光学显微镜检查。

1.4.2染毒方法 将各组剩下的大鼠再分别分成三组每组6只，按不同的剂量，细颗粒物低剂量(PM2.5 1.6 mg/kg bw)、中剂量(PM2.5 8.0 mg/kg bw)、高剂量(PM2.5 40 mg/kg bw)，采用气管滴注的染毒方式，气管滴注量均按1.5 ml/kg bw染毒，每天染毒1次，连续3 d。

1.4.3染毒大鼠的支气管肺泡灌洗 最后1次染毒24 h后，用10%水合氯醛(10 ml/kg)麻醉动物，腹主动脉放血处死动物，暴露气管，夹闭右主支气管，从气管向左肺缓慢注入37℃无菌生理盐水3 ml进行支气管肺泡灌洗，反复3次，经纱布过滤合并回收灌洗液，置于低温离心机中离心，上清液置于-20℃低温保存待测。

1.4.4肺灌洗液中IL-8、IL-17、TNF-α的测定 按试剂盒要求测定各组肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、TNF-α的浓度。

1.5统计学方法 应用SPSS15.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1肺组织病理结果 正常组病理标本经苏木精-伊红(HE)染色后显示大鼠气管、支气管、肺泡结构完整，细支气管上皮无变性，肺泡腔内无渗液。COPD组病理表现为支气管狭窄、变性，肺泡腔扩大，管壁内大量炎性细胞浸润，黏膜层杯状细胞增多，部分细支气管见平滑肌、胶原纤维增生。合并组也表现为炎性细胞增大，支气管狭窄、变形，肺泡腔扩大，但较COPD组轻。见图1。

2.2各组肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、TNF-α浓度 PM2.5对正常组、COPD组、合并组大鼠均产生急性毒性，且存在剂量反应关系，COPD组肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α浓度明显高于正常组(P<0.05)；经1,25(OH)2D3干预，COPD组IL-8、TNF-α浓度低于COPD组，但仍高于正常组(P<0.05)。见表1～表3。

表1 各组肺泡灌洗液中IL-8浓度

表2 各组肺泡灌洗液中IL-17浓度

表3 各组肺泡灌洗液中TNF-α浓度

3 讨 论

近年来，大气污染日益加重，大气细颗粒物(PM2.5)已成为影响我国多数城市空气质量的首要污染物〔5〕，PM2.5在呼吸道停留的时间是其致病的重要因素，沉积在肺间质内的PM2.5引发的慢性炎症反应和氧化损伤可降低肺功能，增加哮喘及COPD的发病率〔6〕。

本研究结果提示IL-8、TNF-α参与COPD气道炎症，Crooks等〔7〕研究发现COPD急性加重期痰IL-8水平升高，中性粒细胞活化的标志物——过氧化物酶(MPO)也升高，两者呈正相关，提示IL-8可能涉及中性粒细胞的趋化和激活过程，过量的IL-8可诱发过度的炎症反应和组织损伤。本研究还提示PM2.5的沉积可加重COPD的气道炎症，1,25(OH)2D3对COPD气道炎症有部分保护作用，但作用有限，可能与样本数量少等有关，可加大样本量进一步观察。

本研究发现COPD组大鼠与合并组大鼠IL-17浓度较正常组亦稍有升高，但差别无统计学意义，可能与大鼠气道炎症因子水平与人类COPD气道炎症不完全一致，或样本量小有关，可继续进一步研究。本研究结果提示PM2.5的毒性作用更倾向于在有基础肺部炎症疾病的机体上发生，而1，25(OH)2D3可减轻COPD气道炎症及损伤，在PM2.5染毒情况下补充1，25(OH)2D3对COPD患者的气道炎症仍部分具有改善作用。

1中华医学会呼吸病学会分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊断指南(2007年修订版)〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2007;46(1)：8-17.

2刘 倩，郝青林.几种细胞因子在慢性阻塞性肺疾病形成机制中的相关研究〔J〕.国际呼吸杂志，2010;30(19)：1173-5.

3Wittke A，Weaver V,Mahon BD,etal.Vitamin D receptor-deficient mice fail to develop experimental allergic asthma〔J〕.J Immunol，2004;173(5)：3432-6.

4Hansdottir S,Monick MM,Hinde SL,etal.Respiratory epithelial cells convert inactive vitamin D to its active form:potential effects on host defense〔J〕.J Immunol,2008;181(10):7090-9.

5邓芙蓉，郭新彪.我国机动车尾气污染及其健康影响研究进展〔J〕.环境与健康杂志，2008;25(5)：174-6.

6Kulkarni N,Pierse N,Rushton L,etal.Carbon in airway macrophages and lung function in children〔J〕.N Engl J Med,2006;355(1):21-30.

7Crooks SW，Bayley DL，Hill SL，etal.Bronchial inflammation in acute bacterial exacerbations of chronic bronchitis：the role of leukotriene-B4〔J〕.Eur Respir J，2000;15(2)：274-80.

〔2017-03-20修回〕

(编辑 袁左鸣)

R56

A

1005-9202(2017)19-4707-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.008

江西省自然科学基金资助项目(No.20142BAB205013)

彭建萍(1972-)，男，硕士，副主任医师，主要从事慢性阻塞性肺疾病的诊断与治疗研究。