刘宽亮　赵志常　高爱平

摘要：肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）是植物苯丙烷合成途径的关键酶之一，其蛋白质活性和转录丰度直接影响植物中黄酮类化合物和芳香族化合物的生物合成量。根据已经报道的C4H基因的序列设计兼并引物，采用3′RACE、5′RACE方法，克隆得到芒果果实C4H基因的全长cDNA序列为1 680 bp。该基因开放阅读框为1 518 bp，编码505个氨基酸，分子量为58.08 ku。蛋白等电点为9.52，分析发现该基因主要定位在线粒体中。通过软件预测得到3种三级蛋白结构图；通过系统发育分析发现，该基因编码的蛋白与橄榄、可可等植物具有较近的亲缘关系。对不同着色的芒果品种的C4H基因表达进行分析发现，红色的贵妃品种中表达量最高，而绿色的桂七品种中表达量最低。

关键词：芒果； C4H基因；克隆；蛋白质；生物信息

中图分类号： S667.701文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）14-0008-04

肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate-4-hydroxylase，简称C4H），别称反式肉桂酸-4-单氧化酶，是细胞色素单加氧酶P450超家族的成员之一[1]，该酶由Russell等首次从豌豆芽中发现[2]，它是苯丙素类化合物生物合成途径里继苯丙氨酸脱氨酶（phenylalanineammonia-iyase，简称PAL）之后的第2个关键调节酶，其作用是将苯丙氨酸途径的合成酶复合物固定在内质网上[3]；同时，在氧和磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，简称NADP）存在下，将反式肉桂酸苯环的4位羟基化生成对-香豆酸[4]。C4H分布在微粒体中，能够原位利用PAL催化产生的苯乙烯酸。普遍认为，肉桂酸-4-羟化酶是苯丙素类物质代谢中一個调节点[2]。由于肉桂酸-4-羟化酶基因在植物次生代谢中有这些重要的作用，因此被广泛关注。自上世纪80年代以来，肉桂酸-4-羟化酶的基因克隆逐渐成为一个研究热点。迄今，已有拟南芥、大豆、花生、杜仲等50多种植物的C4H基因被分离出来[5-10]。与苯丙氨酸脱氨酶基因类似，肉桂酸-4-羟化酶基因的拷贝数在不同植物之间存在差异。如：苜蓿C4H基因有2个拷贝，豌豆的C4H基因只有1个拷贝，绿豆和长春花的C4H基因家族都有多个成员。这些不同植物种的C4H基因所编码的氨基酸序列相似性极高，同源性普遍在85%左右。但玉米和法国菜豆中的2个C4H酶蛋白氨基酸序列例外，同源性只有60%[11]。C4H基因在植物各组织中均具有很高的活性[11-14]，研究表明，C4H的蛋白质活性和转录丰度直接影响植物中黄酮类化合物、木质素、芳香族类化合物的合成等多条代谢途径[15-16]。芒果是重要的热带、亚热带果树，果实色彩多样，有绿色、黄色、浅黄色、红色、橙红色等。芒果果实富含类胡萝卜素、花色素苷等物质，其中花色素苷合成途径是红色芒果果实着色的一个主要的代谢途径。芒果果实C4H基因的研究工作未见报道，本研究采用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，简称RACE）从芒果的果实中克隆得到1个C4H基因，深入探讨该基因在芒果果实花色素苷合成的作用机制及其对果实着色的影响，借以深入揭示该基因在芒果果实花色素苷生物合成的分子机制，以期为芒果果实着色研究提供一定理论依据。

1材料与方法

1.1材料

试验所用芒果（品种有红色贵妃、黄色金煌、绿色桂七）果实取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所的农业部芒果种质资源圃。引物委托上海英俊生物工程技术服务有限公司合成，其他药品如：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，简称为IPTG）、酵母抽提物（yeast extract，简称YE）、氨苄青霉素（ampicillin，简称为Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（简称为X-GaL）、pMD-19T载体及各种酶均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2试验方法

1.2.1芒果总RNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司生产的总RNA提取试剂盒用RNase-free无菌水溶解，并用宝生物工程（大连）有限公司的DNase试剂盒进行DNA去除，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和DNA是否去除干净。

1.2.2PCR反应程序94 ℃预变性4 min；95 ℃变性50 s，50 ℃复性50 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；最后72 ℃延伸 7 min； 反应体系为25 μL，其中含10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL、25 ng DNA模板、20 μmol引物、1.0 U Taq DNA聚合酶、5.0 mmol dNTPs；[JP3]扩增反应结束后取10 μL进行扩增产物的电泳，采用gelred染色后在紫外凝胶成像仪上观察、拍照分析。

1.3C4H基因全长cDNA序列的获得

以贵妃芒果的果实总RNA作为模板，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech）反转录合成第一链cDNA，并参照该试剂盒的说明书进行cDNA 3′端、5′末端 cDNA 的扩增。根据cDNA片段的测序结果，分别设计2条上游引物，以接头为锚定引物进行半巢式PCR反应。根据测得的片段和得到的cDNA 3′端、5′末端的序列结果拼接该基因的全长 cDNA。以cDNA为模板，设计特异引物，进行全长cDNA序列扩增反应。

1.4C4H基因氨基酸序列的结构特征和分子进化的分析

将测得的全长cDNA序列进行NCBI序列比对，确定该全长序列是否为C4H基因，并进行其他物种C4H基因的比对，采用DNAMAN软件分析基因核苷酸、氨基酸的结构特征和同源性；分析该基因所推定氨基酸序列进行多序列比较并构建系统树。endprint

1.5表达分析

分别提取不同芒果品种的RNA，反转为cDNA，并采用Primer 5.0设计引物进行RT-PCR的扩增。RT-PCR分析采用的内参引物序列为：actin-F 5′-AATGGAACTGGAATG GTCAAGGC-3′，actin-R5′-TGCCAGATCTTCTCCATGTCA TCCCA-3′；目的基因扩增采用的引物为：C4H-F，5′-CAGCATAGCCTAGCACATACTC-3′，C4H-R 5′-CAATG GAGCATATACGAAACTAT-3′，PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，并采用Quantity One软件进行数据分析，计算相对表达量。

2结果与分析

2.1C4H基因的获得

根据RACE扩增结果进行拼接最后得到C4H基因的全长cDNA序列，电泳收测序后全长序列为1 680 bp，分析发现，开放阅读框为1 518 bp，编码505个氨基酸序列（图1）。通过NCBI上已经登录的水稻、大豆、橄榄、可可的C4H蛋白序列进行比对（图2）发现，克隆的基因为C4H基因。

利用NCBI的Blast进行保守区查找，获得序列的保守Domain（CD）。结果表明，C4H有PLN02394（trans-cinnamate 4-monooxygenase）、p450（cytochrome P450）、CypX（secondary metabolites biosynthesis，transport and catabolism）P450_cycloAA_1（cyclodipeptide synthase-associated）、PLN02738（carotene beta-ring hydroxylase）等结合域。对其蛋白二级结构进行预测发现，芒果C4H蛋白的二级结构主要以蛋白二级结构元件以α-螺旋结构和无规则卷曲为主，也具有少量的β-折叠结构（图4）。采用Bioedit软件的Kyte和Doolittle算法对C4H蛋白的亲水/疏水性（正值表示疏水性，负值表示亲水性）进行分析，C4H蛋白所含氨基酸的值主要介于-2.2～31之间（图5），采用WoLFPSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）软件对C4H蛋白进行定位预测发现，该基因定位在线粒体中，采用Swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）在线软件对蛋白的三级结构进行预测，推导出该蛋白有3种结构构型（图6）。采用DNAMAN软件分析发现，芒果C4H蛋白与橄榄、可可等植物具有较近的亲缘关系（图7）。

2.3C4H基因的RT-PCR分析

对不同着色品种的芒果果皮进行RT-PCR分析结果发现，该基因在红色果皮贵妃的果实中表达较多，黄色果皮金煌的果实中次之，而绿色果皮桂七的果实中相对表达较少（图8），初步推断C4H基因可能与红色果实的花色素苷合成有密切的关系。

3讨论

本研究成功地从芒果果实中分离得到1个全长C4H基因，该基因cDNA的开放阅读框为1 518 bp，编码505个氨基酸。通过在线软件对cDNA和蛋白序列分析证实该序列是植物C4H基因的一员。芒果C4H基因与所选其他物种C4H基因序列相比较发现，无论在全长cDNA序列上还是在其编码氨基酸序列上都具有较高保守的结构域细胞色素P450。同时，通过与其他部分物种的氨基酸序列构建系统发生树发现，芒果C4H基因编码的蛋白与橄榄、可可、棉花等植物聚为一类。植物黄酮类物质的生物合成相关的蛋白一般定位于内质网外膜上，由一系列特定的黄酮合成相关酶组成的多酶复合体连续合成并转运到特定的亚细胞结构中[17]。C4H蛋白的N-末端的膜锚定信号基（signal-anchor sequence），使其定位于内质网外膜上，参与苯丙烷类代谢途径中多酶复合体的亚细胞定位和内质网上电子链的化学传递[18]，进而进行黄酮类物质的生物合成。Baek等在黑莓中发现，黄酮积累量与C4H表达量在果实发育的不同时期表现了同步增加或减少的变化趋势[19]。本研究对芒果不同果实着色分析发现，红色的贵妃品种中表达量最高，而绿色的桂七品种中表达量最低，这与花色素苷的含量有一定的相关性。在大蒜中C4H的转录在根中最高，而在苯丙素类物质富集的茎中却很低。推测大蒜中苯丙素类物质可能在根部合成后转运到茎中[20]。在逆境胁迫下，植物可通过调节一系列合成相关酶基因的转录水平从而影响其黄酮类和芳香族类的合成和积累[8]，其中就包括C4H。Ryan等在矮牵牛花中的研究发现，在UV-B胁迫处理下，C4H等基因表达量的增加使得植物组织中总黄酮含量增加[21]。Liu等发现K离子缺乏诱导的菊花中C4H等基因的表達量减少，造成了该部位黄酮含量的降低[22]。芒果C4H基因是芒果花色素苷合成代谢途径中的一个关键的基因，对芒果果皮红色的形成具有重要的作用。芒果果实的着色也受得了光照、温度等条件的影响，这些因素是否影响了C4H基因的表达，同时，对该基因功能的深入研究须要进一步进行转基因植物表达验证。

参考文献：

[1]Barber M S，Mitchell H J. Regulation of phenylpropanoid metabolism in relation to lignin biosynthesis in plants[J]. International Review of Cytology，1997，172（8）：243-293.

[2]Russell D W，Conn E E. The cinnamic acid 4-hydroxylase of pea seedlings[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，1967，122（1）：256-258.endprint

[3]李波，梁颖，柴友荣. 植物肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）基因的研究进展[J]. 分子植物育种，2006，4（增刊1）：55-65.

[4]Mizutani M，Ward E，Dimaio J，et al. Molecular cloning and sequencing of a cDNA encoding mung bean cytochrome P450（P450C4H） possessing cinnamate 4-hydroxylase activity[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1993，190（3）：875-880.

[5]王安娜，王婵婵，吴蕾，等. 大豆C4H基因克隆及生物信息学分析[J]. 东北农业大学学报，2010，41（4）：12-16.

[6]杜红岩. 杜仲活性成分与药理研究的新进展[J]. 经济林研究，2003，21（2）：58-61.

[7]陈安和，李加纳，柴友荣，等. 羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸-4-羟化酶基因的克隆及分析[J]. 园艺学报，2007，34（4）：915-922.

[8]陈鸿翰，袁梦求，李双江，等. 苦荞肉桂酸羟化酶基因（FtC4H）的克隆及其UV-B脅迫下的组织表达[J]. 农业生物技术学报，2013，21（2）：137-147.

[9]李莉，赵越，马君兰. 苯丙氨酸代谢途径关键酶：PAL、C4H、4CL研究新进展[J]. 生物信息学，2007，5（4）：187-189.

[10]罗小娇，刘新春，杨晓云，等. 青稞C4H基因的克隆及组织表达分析[J]. 植物遗传资源学报，2014，15（3）：589-596.

[11]Fahrendorf T，Dixon R A. Stress responses in alfalfa （Medicago sativa L.）. Ⅹ[KG-0.5mm]Ⅴ[KG-0.5mm]Ⅲ：molecular cloning and expression of the elicitor-inducible cinnamic acid 4-hydroxylase cytochrome P450[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，1993，305（2）：509-515.

[12]Mizutani M，Ward E，Dimaio J，et al. Molecular cloning and sequencing of a cDNA encoding mung bean cytochrome P450 （P450C4H） possessing cinnamate 4-hydroxylase activity[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1993，190（3）：875-880.

[13]Teutsch H G，Hasenfratz M P，Lesot A，et al. Isolation and sequence of a cDNA encoding the Jerusalem artichoke cinnamate 4-hydroxylase，a major plant cytochrome P450 involved in the general phenylpropanoid pathway[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，1993，90（9）：4102-4106.

[14]Millar D J，Long M，Donovan G，et al. Introduction of sense constructs of cinnamate 4-hydroxylase （CYP73A24） in transgenic tomato plants shows opposite effects on flux into stem lignin and fruit flavonoids[J]. Phytochemistry，2007，68（11）：1497-1509.

[15]Ryan K G，Swinny E E，Markham K R，et al. Flavonoid gene expression and UV photoprotection in transgenic and mutant Petunia leaves[J]. Phytochemistry，2002，59（1）：23-32.

[16]Sewalt V J H，Ni W，Blount J W，et al. Reduced lignin content and altered lignin composition in transgenic tobacco down-regulated in expression of L-phenylalanine ammonialyase or cinnamate 4-hydroxylase[J]. Plant Physiology，1997，115（1）：41-50.

[17]Saslowsky D E，Warek U，Winkel B S. Nuclear localization of flavonoid enzymes in Arabidopsis[J]. Journal of Biological Chemistry，2005，280（25）：23735-23740.

[18]Williams P A，Cosme J，Sridhar V，et al. Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase：structural adaptations for membrane binding and functional diversity[J]. Molecular Cell，2000，5（1）：121-131.

[19]Baek M H，Chung B Y，Kim J H，et al. cDNA cloning and expression pattern of cinnamate-4-hydroxylase in the Korean black raspberry[J]. BMB Reports，2008，41（7）：529-536.

[20]Tuan P A，Park N I，Li X，et al. Molecular cloning and characterization of phenylalanine ammonia-lyase and cinnamate 4-hydroxylase in the phenylpropanoid biosynthesis pathway in garlic （Allium sativum）[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（20）：10911-10917.

[21]Ryan K G，Swinny E E，Markham K R，et al. Flavonoid gene expression and UV photoprotection in transgenic and mutant Petunia leaves[J]. Phytochemistry，2002，59（1）：23-32.

[22]Liu W，Zhu D，Liu D，et al. Comparative metabolic activity related to flavonoid synthesis in leaves and flowers of Chrysanthemum morifolium in response to K deficiency[J]. Plant and Soil，2010，335（1/2）：325-337.endprint