史会影，刘振华，占卫红，雷 航，王 琳，梁瑞霞，任伟宏，汤兵祥#

1)郑州大学第一附属医院呼吸内科 郑州 450052 2)复旦大学附属闵行中心医院检验科 上海201100 3)上海交通大学基础医学院病原生物学教研室 上海 200025 4)复旦大学附属公共卫生临床中心 上海 200540 5)河南省胸科医院呼吸内科 郑州 450008 6)河南中医药大学第一附属医院检验科 郑州 450008

复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615cELISPOT辅助诊断活动性肺结核的应用价值*

史会影1)，刘振华2)，占卫红3)，雷 航3)，王 琳4)，梁瑞霞5)，任伟宏6)，汤兵祥5)#

1)郑州大学第一附属医院呼吸内科 郑州 450052 2)复旦大学附属闵行中心医院检验科 上海201100 3)上海交通大学基础医学院病原生物学教研室 上海 200025 4)复旦大学附属公共卫生临床中心 上海 200540 5)河南省胸科医院呼吸内科 郑州 450008 6)河南中医药大学第一附属医院检验科 郑州 450008

肺结核；ESAT-6;CFP-10;Rv3615c

目的：评估结核分枝杆菌复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c在活动性肺结核诊断中的应用价值。方法选取肺结核病患者78例，非结核性肺部疾病患者27例和健康体检者39例，分别用复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库作为抗原刺激单个核淋巴细胞(PBMCs)，采用酶联免疫斑点试验检测斑点形成细胞数，判断肺结核感染情况。结果复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库检测结核分枝杆菌感染的敏感性依次为87.2%(68/78)、80.8%(63/78)、76.9%(60/78)，特异性依次为81.8%(54/66)、84.8%(56/66)、87.9%(58/66)。结论复合抗原ESAT-6 /CFP-10 /Rv3615c有较高的敏感性和特异性，对活动性肺结核的辅助诊断有一定的临床应用价值。

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的慢性传染病，主要通过呼吸道传播。全身各个脏器均能引起结核感染，其中以肺部感染最为常见。目前TB仍是严重威胁人类健康的传染病。2015年全球新增TB病例1 040万，死亡180万，但仅有610万人明确诊断[1]。因此早期快速诊断MTB感染是控制和预防TB的关键。目前的TB诊断方法仍不能满足早期快速诊断的需要。由于MTB是一种胞内寄生菌，因此，血清中的抗体很难进入细胞内对其进行杀灭；机体抗结核感染需T淋巴细胞介导的细胞免疫参与，细胞介导的免疫反应是机体对结核感染防御的主要免疫机制[2]。2011年，Millington等[3]发现Rv3615c在细胞免疫中发挥重要作用，能够产生与传统用于MTB感染检测的ESAT-6、CFP-10抗原相当水平的T细胞免疫反应。因此，该研究采用MTB重组抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c(E/C/R)进行酶联免疫斑点实验(ELISPOT)，检测产生γ干扰素效应T淋巴细胞的数量，判断结核菌的感染情况，并与结核菌特异性抗原ESAT-6、CFP-10进行比较，探讨其对活动性肺结核的辅助诊断价值。

1 对象与方法

1.1研究对象肺结核组为河南省胸科医院的住院患者，共78例，其中菌阳33例，菌阴45 例；年龄18～78(41.8±17.4)岁；女23例，男55例。非结核性肺部疾病组(简称肺部疾病组)为河南省胸科医院住院患者，共27例，其中肺炎15 例，肺癌9 例，支气管囊肿1例，支气管扩张2例，年龄28～84(43.3±16.5)。健康对照组为在复旦大学附属闵行中心医院进行健康体检的健康人，共39例，年龄18～51(30.3±7.1岁)。肺结核组入选标准参照2001年中华医学会结核病分会肺结核诊断标准[4]。(1)菌阳肺结核：痰抗酸杆菌涂片连续2次(+)，或1次()，或1次培养阳性。(2)菌阴肺结核(痰抗酸杆菌涂片3次阴性及1次培养阴性)：①典型肺结核临床症状和胸部X线表现。②抗结核治疗有效。③临床可排除其他非结核性肺部疾患。④PPD强阳性；血清抗结核抗体阳性。⑤痰结核菌PCR+ 探针检测呈阳性。⑥肺外组织病理证实结核病变。⑦BALF检出抗酸分枝杆菌。⑧支气管或肺部组织病理证实结核病变，具备①～⑥项中3项或⑦、⑧项中任何1项可确诊。所有患者无 HIV 感染，无糖尿病、肝炎等并发症，无严重的肝、肾功能障碍，均有 BCG 接种史，抗结核治疗时间小于2周。

1.2主要仪器和试剂96孔ELISPOT板购自美国Millipore公司，植物凝集素(PHA)、ESAT-6肽段库、CFP-10肽段库购自深圳达科为生物技术有限公司，人IFN-γ ELISPOT 检测试剂盒购自美国eBioScience公司；二级生物安全柜(力新仪器上海有限公司)，CO2培养箱(HERACELL 150i)，BioReader4000型酶联斑点分析仪(德国Biosys GmbH公司)，复合抗原E/C/R由北京旷博生物科技有限公司提供。

1.3外周血单个核淋巴细胞的分离和计数采集5 mL外周血标本于肝素钠抗凝的真空采血管内，血标本注入管内后，立即轻轻颠倒5次，充分混匀。在抗凝血中加入RPMI 1640培养基进行稀释混匀。新的离心管中加入一定体积的Ficoll淋巴细胞分离液，然后将稀释后的血样轻轻地平铺到分离液液面上方(分离液抗凝血RPMI 1640=111，体积比)；放入离心机，18 ℃、800g离心20 min；离心结束后用吸管吸取白色云雾状外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)层至另一15 mL无菌尖底离心管中，加入RPMI 1640培养基至10 mL，18 ℃、800g离心10 min；弃上清，重悬后加入7 mL RPMI 1640培养基，700g离心10 min；弃上清，加0.5 mL AIM-V培养基重悬，吸取10 μL，使用台盼蓝染色显微镜下计数，根据计数结果调整细胞悬液密度为2.5×106mL-1。

1.4IFN-γ释放水平的ELISPOT检测在无包被的96孔ELISPOT板中加入稀释后的捕获单克隆抗体，4 ℃过夜。加入含体积分数10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基室温封闭1 h；每孔加入细胞密度2.5×106mL-1PBMCs悬液，阴性对照孔加入100 μL AIM-V培养基，阳性对照孔加入100 μL植物血凝素，实验孔分别加入ESAT-6、CFP-10及复合抗原E/C/R，终质量浓度均为10 mg/L。样品加完后，放入37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育18～24 h。加入100 μL稀释后的检测抗体，室温孵育2 h。洗板，加入100 μL酶结合物液，室温孵育45 min。洗板，每孔加入100 μL显色底物AEC，室温避光孵育15 min，弃显色液，用去离子水终止反应。反应板置于背光、通风良好干燥的环境中；应用Biosys GmbH公司的BioReader 4000型酶联免疫斑点分析仪计数斑点。结果判定标准：当阴性对照孔内斑点数<10并且对照孔内斑点数>20时视为实验有效，空白对照孔斑点数为0～5个，任何一个检测孔斑点数减去空白对照孔斑点数≥6；空白对照孔斑点数为6～10个，且检测孔斑点数≥2倍空白对照孔斑点数，以上两种情况均判定为阳性，如果不符合上述标准且阳性质控孔正常时检测结果为阴性。采用E/C/R、ESAT- 6、CFP- 10作为结核分枝杆菌抗原刺激每个受检者的PBMCs分泌IFN-γ，同时设定阴性对照及阳性对照进行质控，实验孔的SFCs依照上述“结果判定标准”进行分析。

1.5统计学处理采用SPSS 19.0进行分析，散点图绘制采用GraphPad Prism 5。应用校正χ2检验比较E/C/R与ESAT-6、CFP-10的EILSPOT阳性率的差异，应用Mann-WhitneyU检验比较两组间斑点形成细胞数(spot forming cells，SFCs)的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1肺结核组和对照组ELISPOT斑点形成结果见图1。

A、F：阴性对照；B、G：阳性；C、H：ESAT- 6；D、I：CFP- 10；E、J：E/C/R。 图1 健康对照组(A～E)与肺结核组(F～J)ELISPOT结果

2.2复合抗原E/C/R与ESAT-6、CFP-10的ELISPOT结果比较复合抗原E/C/R和ESAT-6、CFP-10检测肺结核病患者、肺部疾病患者及健康对照组的结核菌抗原阳性率见表1，正常对照组与肺部疾病组2组间差异无统计学意义，而肺结核组结核菌抗原阳性率均高于肺部疾病组和正常对照组，复合抗原E/C/R和ESAT-6、CFP-10敏感性分别为87.2%(68/78)、80.8%(63/78)、76.9%(60/78)；特异性分别为81.8%(54/66)、84.8%(56/66)、87.9%(58/66)。

表1复合抗原E/C/R、ESAT-6

和CFP-10的ELISPOT诊断结果比较例(%)

2.3复合抗原E/C/R作用后3组受试者分泌IFN-γT淋巴细胞应答水平比较结果见图2。复合抗原E/C/R在肺结核组的SFC数均高于健康组及肺部疾病组(U=283.000、217.500，P均<0.001)，肺部疾病组与健康组的SFC数比较差异无统计学意义(U=398.000，P=0.082)。

图2 不同抗原在结核组、非结核性 肺部疾病组和健康对照组间SFCs形成数量的比较

2.4 3个抗原分别检测菌阳和菌阴肺结核组的结果见表2。

表2 E/C/R、ESAT-6、CFP-10分别在菌阳和菌阴肺结核中的检测结果 例(%)

3 讨论

前期该课题组用血清学评估出一个敏感性和特异性都较高的M.tuberculosisRD5区的特异性抗原Rv3117，证实DDA/MPL佐剂具有提高免疫BCG小鼠的体液免疫和细胞免疫的作用[5-7]；同时通过ELISA实验对重组蛋白Rv0315进行初步的血清学抗原活性评价[8]，显示Rv0315具有一定的血清学诊断价值，其后分别采用MTB重组蛋白Rv0315及E/C/R进行ELISPOT试验，探讨基于Rv0315及E/C/R抗原的ELISPOT对活动性肺结核病的辅助诊断价值[9-10]。2011年有学者[3]报道Rv3615c是一个高度依赖结核分枝杆菌基因组RD1区免疫调控的分泌抗原，非RD1区编码，与CFP-10和ESAT-6大小相近及序列具有同源性，包含了多个肽段的集合体，可以提高检测的灵敏度，该研究将3种复合抗原作为结核分枝杆菌刺激抗原，评估其在细胞免疫诊断价值。

建立在细胞免疫基础上的γ干扰素释放实验(IFN-gamma release assays，IGRAs)近年来得到了迅速发展，目前商品化的IGRA共有2种：QuantiFERON-TB(CellestisLtd，Australia)及T-SPOT.TB(Oxford Immunotec，UK)，这些实验都是用MTB RD1区域编码的早期分泌抗原靶蛋白(early secreting antigen target 6kd，ESAT-6)和培养滤液蛋白(culture filtrate protein 10kd，CFP10)作为检测刺激抗原，通过IFN-γ释放水平，间接检测MTB感染。相比结核菌素皮肤试验(TST)所应用的抗原——纯化蛋白衍生物(PPD)，这些抗原具有更高的特异性,王晓艳等[11]对985例结核病患者同时进行PPD皮肤测试和ELISA法定量检测血清IFN-γ的含量，对其结果进行回顾性分析，TB-IGRA的敏感性和特异性(88.4%、90.8%)显著高于PPD(77.3%、56.7%)。但现有的IGRAs仍然存在诸多不足，限制了其在结核病诊断中的应用，主要集中在敏感性仍然有待提高，特别是在使用免疫抑制剂、吸烟、淋巴细胞减少症患者容易出现假阴性结果[12-14]。为了改进现有的IGRA诊断技术，采用增加MTB特异性抗原的方法来提高肺结核诊断的敏感性和特异性。因为任何单一或两个MTB特异性抗原多肽不足以覆盖MTB引起T淋巴细胞免疫应答的所有表位，采用多种特异性抗原联合可以提高敏感性。因此寻找用于诊断的新型抗原标志物就显得尤为重要。

该研究结果显示，肺结核组3种蛋白的T淋巴细胞反应均高于健康组及肺部疾病组。为了评价非结核感染是否会影响抗原的特异性免疫反应，作者比较了肺部疾病组与健康组抗原特异性T细胞反应，结果显示3种抗原差异均无统计学意义。以上结果表明非特异性免疫刺激对E/C/R、ESAT-6、CFP-10抗原的细胞免疫反应无影响。

复合抗原E/C/R的ELISPOT阳性率明显高于ESAT-6、CFP-10，表明Rv3615c在结核病的细胞学诊断中发挥了重要的作用；其特异性略低于ESAT-6、CFP-10，说明该抗原在提高敏感性的同时不可避免地会引起特异性的下降，可能与Rv3615c存在一些非特异性表位有关。Qiu等[15]研究发现，以细菌学诊断为金标准，应用Rv3615c、ESAT-6和CFP-10 3抗原组成的肽库与T-SPOT.TB及TB-IGRA相比较，其敏感度及特异度(86.2%，87.2%)高于TB-IGRA(83.9%，88.6%)，稍低于T-SPOT.TB(89.7%，91.1%)，差异无统计学意义，作者的研究结果与该研究结果相似。因此，应用Rv3615c、ESAT-6、CFP-10抗原组合能够有效地提高结核菌感染的检出率，但当合并其他疾病时(尤其是免疫抑制性疾病)可能产生较高的假阴性，需慎重考虑。作者对菌阳及菌阴肺结核病患者结核特异抗原的阳性率分析表明，痰菌阳性与阴性结核病患者的阳性率差异无统计学意义。由于临床上存在大量的痰菌阴性的TB患者，因此不依赖病原菌检测，对痰菌阴性的肺结核具有重要的诊断价值。

综上所述，复合抗原E/C/R在肺结核的细胞免疫学诊断中具有较高的敏感性和特异性，对肺结核具有重要的辅助诊断价值。

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(2016-11-24收稿 责任编辑赵秋民)

Diagnositc value of ELISPOT by multiple antigens in detection of active pulmonary tuberculosis

SHIHuiying1),LIUZhenhua2),ZHANWeihong3),LEIHang3),WANGLin4),LIANGRuixia5),RENWeihong6),TANGBingxiang5)

1)DepartmentofRespiratoryMedicine，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052 2)DepartmentofClinicalLaboratory，MinhangCentralHospital,FudanUniversity，Shanghai201100 3)DepartmentofPathogenicBiology，CollegeofBasicMedicalSciences，ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200025 4)ClinicalCenterofPublicHealth，FudanUniversity，Shanghai200540 5)DepartmentofRespiratoryMedicine，HenanChestHospital，Zhengzhou450008 6)DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450008

pulmonary tuberculosis；ESAT-6；CFP-10；Rv3615c

Aim: To evaluate the value of mycobacterium tuberculosis composite antigen ESAT-6/CFP-10/Rv3615c in the diagnosis of active pulmonary tuberculosis. Methods: Seventy-eight patients with pulmonary tuberculosis, 27 patients with non-tuberculous lung disease and 39 healthy control were selected. The peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were stimulated with the composite antigen ESAT-6/CFP-10/Rv3615c, ESAT-6 peptide or CFP-10 peptide. SFCs was detected by ELISPOT to determine the situation of tuberculosis infection. Results: The sensitivities of mycobacterium tuberculosis infection detected by the composite antigen ESAT-6/CFP-10/Rv3615c, ESAT-6 peptide and CFP-10 peptide were 87.2%(68/78), 80.8%(63/78), 76.9%(60/78) , respectively, and the specificities were 81.8%(54/66), 84.8%(56/66) and 87.9%(58/66) , respectively. Conclusion: The complex antigen ESAT-6/CFP-10/Rv3615c has high sensitivity and specificity, and is of certain clinical value for the auxiliary diagnosis of active pulmonary tuberculosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.028

*“十二·五”国家科技重大专项 2013ZX10003002-005；国家自然科学基金 81271794；河南省卫生厅科技攻关项目 201204110

R521

#通信作者，男，1956年4月生，硕士，主任医师，研究方向：呼吸系统疾病基础及临床，E-mail：tangbingxiang01@sina.com