何灿+周易+葛曦雨+曲瑞丹+严文娟+王文君+高红亮+黄静

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.044

摘要：通过对苯酚-次氯酸盐法（试管体系）反应体系微量化，借助酶标仪动态检测96孔板中蛋白质谷氨酰胺酶与底物产生氨的最大速度Δmaxv，对于不同浓度的标准PG样品与不同酶活的发酵液，Δmaxv与酶活间呈显著正相关（r=0.999、r=0.890），故用Δmaxv代替酶活进行快速测定。选用96孔板作为快速测量体系，标准PG样品与发酵液在96孔板内部60孔中Δmaxv变异系数分别为10%、18%。利用该方法进行亚硝酸钠（nitrite，NIT）诱变初筛，0.6 mg/mL 的NIT处理109 CFU/mL菌液20 min，涂板后筛选400株菌株样本，利用该方法最终得到1株是出发菌株酶活1.825倍且稳定性良好的菌株，可继续作为出发菌株应用于后续诱变筛选工作中。该方法可以准确、快速地提高诱变初筛的效率，为以后的育种工作奠定了基础。

关键词：苯酚-次氯酸盐法；快速微量化；Δmaxv；蛋白质谷氨酰胺酶

中图分类号： TS201.3文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0153-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-01-28

基金项目：国家自然科学基金（编号：31170920）；大夏大学生科研基金项目（编号：2014DX-333）。

作者简介：何灿（1992—），女，安徽六安人，硕士研究生，主要从事食品微生物研究。E-mail：hc13524170366@163.com。

通信作者：黄静，博士，副教授，主要从事食品微生物研究。E-mail：jhuang@ecnu.bio.edu.cn。

[ZK）]

植物蛋白如大豆蛋白、小麦蛋白和玉米蛋白等在食品工业中应用非常广泛。但由于大部分植物蛋白在弱酸性环境中（大多数食品系统的pH范围）存在溶解性差、稳定性低的问题，造成其应用范围受到了限制[1]。采用蛋白质脱酰胺法对植物蛋白进行改性，增强其相关功能特性，扩大其在食品领域的应用是目前热门的研究方向[1-3]。蛋白质谷氨酰胺酶（protein-glutaminase，PG）是一种能够催化L-β-谷氨酰胺残基，生成L-谷氨酸和氨的酶，并且对于天冬酰胺残基以及游离的谷氨酰胺残基的酰胺键没有作用[4]，相比较于谷氨酰胺转氨酶以及肽谷氨酰胺酶具有无蛋白交联、无副作用等优点[5]。目前PG已应用到小麦蛋白、米谷蛋白、麦麸蛋白等多种蛋白的改性试验中，试验结果证明其可明显地增强蛋白质脱酰胺程度[6]。

2000年Yamaguchi等从解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）9670T中首次发现了PG[7]。由于产PG的菌株稀少，世界上对PG的研究主要为该酶的结构和应用[8]。近年来，华东师范大学微生物实验室致力于产PG菌种研究，从全国各地土壤中一共筛选到9株产PG的细菌，经鉴定，其中7株为产吲哚金黄杆菌（C.indologenes），1株为解朊金黄杆菌（C.proteolyticum），1株为黏金黄杆菌（C.gleum），其酶活大小在0.10～0.72 U/mL之间，其中2013年从四川省土样中筛选分离到的1株能够产生PG的解朊金黄杆菌Y8-10-1，经鉴定与已被批准可用于食品工业生产的菌株9670T为同一来源菌株，两者酶活均为0.40 U/mL左右[9]，低酶活限制了其在工业生产中的大规模应用。

笔者实验室欲通过化学诱变、紫外诱变等传统育种方法，以Y8-10-1作为出发菌株得到高产PG菌株，但由于传统诱变方法操作复杂、筛选样本量大，并且由于国际通用的测定PG酶活的苯酚-次氯酸盐方法[10-11]试管用量大、操作复杂、耗时长等缺点难以在初筛过程中大规模应用。因此，准确、快速微量化测定PG酶活方法的建立在高通量筛选高产蛋白质谷氨酰胺酶过程中有着重要的意义。

本试验基于苯酚-次氯酸盐方法，借助酶标仪快速检测功能，利用PG与底物反应过程中产生氨的显色反应最大速率Δmaxv代替酶活，建立适合高通量筛选的96孔微孔板反应体系，30 min可检测60个以上的反应，完全达到高通量筛选的要求[12]，并与苯酚-次氯酸盐方法进行比较以验证该方法的可行性。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种产PG的解阮金黄杆菌Y8-10-1，由华东师范大学微生物实验室保藏。

1.1.2培养基种子培养基（1 000 mL）：10 g多聚蛋白胨，2 g 酵母提取物，1 g MgSO4·7H2O，加ddH2O至1 000 mL，调节pH值至7.0。发酵培养基（1 000 mL）：5 g乳糖，10 g多聚蛋白胨，1.7 g NaH2PO4·H2O，0.25 g K2HPO4，0.25 g MgSO4·7H2O，0.05 g FeSO4·7H2O，加ddH2O至1 000 mL，调节pH值至7.2。

1.1.3试剂与仪器

主要试剂：176 mmol/L PBS （pH值为 6.5）：（1）0.2 mol/L Na2HPO4溶液：称取 71.6 g Na2HPO4·12H2O，用ddH2O定容到1 000 mL；（2）0.2 mol/L NaH2PO4溶液：称取31.2 g NaH2PO4·2H2O，用ddH2O定容到 1 000 mL。取31.5 mL（1）溶液、68.5 mL（2）溶液，以及11364 mL ddH2O，混合均匀。

底物溶液（反应液）：称取0.337 g二肽Cbz-Gln-Gly，用176 mmol/L PBS（pH值為6.5）定容至100 mL。400 mmol/L CCl3COOH溶液（终止液）：称取6.536 g CCl3COOH，用ddH2O定容至100 mL。显色剂A：称取 40.46 g 苯酚和0.15 g Na2Fe（CN）5NO2·H2O，用ddH2O定容至 1 000 mL。显色剂B：称取49.94 g KOH，用ddH2O定容至 1 000 mL。显色剂C：称取200.40 g K2CO3，加适量ddH2O溶解，待冷却后加8.33 mL NaClO溶液，ddH2O定容至 1 000 mL。醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值为4.5）：取18 g醋酸钠，加9.8 mL冰醋酸，再加水定容至1 000 mL。NIT母液：称取0.1 g NIT，溶于20 mL醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值为45）。endprint

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：配制具有12%的分离胶和5%的浓缩胶，插10孔样品梳，胶厚1.5 mm。标准PG样品（50 U/g），购自Amano公司；底物Cbz-Gln-Gly，购自Sigama公司；大豆蛋白胨、多聚蛋白胨生化纯，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母提取物，购自安琪酵母股份有限公司；苯酚、硝普钠、亚硝酸钠（NIT）等常规试剂分析纯，购自上海润捷化学试剂公司。恒温调速回旋式摇床DKY-Ⅱ，购自上海杜科自动化设备有限公司；Synergy HT多功能酶标仪，购自BioTek公司，Labofuge 400R水平离心机，购自Thermo Scientific公司。

1.2试验方法

1.2.1苯酚-次氯酸盐法测定PG酶活——试管法

参照国际通用的测定氨含量的苯酚次氯酸法[10-11]进行PG酶活测定。

试验组：取100 μL酶样品溶液加入试管中，向其中加入1 000 μL已在37 ℃水浴中预热10 min的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合液在37 ℃恒温培养箱中温育30 min。然后加入1 000 μL的400 mmol/L CCl3COOH溶液，终止反应。

对照组：取100 μL酶样品溶液加入试管中，向其中加入1 000 μL已在37 ℃水浴中预热10 min的400 mmol/L CCl3COOH溶液，混合液在37 ℃恒温培养箱中温育30 min。然后加入 1 000 μL 的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合均匀。

从每支试管中吸取120 μL溶液加入到新试管中，再加入480 μL蒸馏水，混合均匀，然后向试管中依次加入900 μL显色剂A、450 μL显色剂B和900 μL显色剂C。混合均匀后置于37 ℃恒温培养箱中温育20 min，在酶标仪630 nm下测定吸光度。

1个酶活单位定义为1 min催化底物生成1 μmol氨需要的酶量，根据以下公式计算蛋白质谷氨酰胺酶活力。

[JZ（][HT9.，8.]蛋白质谷氨酰胺酶活力=[SX（]（试验组氨含量-对照组氨含量）×[SX（]2.10.1[SX）]17.03×30×a[SX）][HT]。[JZ）]

式中：蛋白质谷氨酰胺酶活力单位为U/mL；[SX（]2.10.1[SX）]为反应液与酶液的体积比；17.03为氨的相对分子质量；30为反应时间，min；a为氨标准曲线的斜率。

1.2.2基于苯酚-次氯酸法测定PG Δmaxv——96孔板体系

1.2.2.196孔板体系测定PG Δmaxv

试验组：取10 μL酶样品溶液加入孔中，向其中加入100 μL已在37 ℃水浴中预热10 min的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合液在37 ℃恒温培养箱中温育15 min。

对照组：在之前的研究中发现，PG在80 ℃下温育10 min后可完全失活[13]。故对照组取10 μL 80 ℃高温失活的酶样品溶液加入孔中，向其中加入100 μL已在37 ℃水浴中预热10 min的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合液在37 ℃恒溫培养箱中温育15 min。

每孔中加入60 μL显色剂A、30 μL显色剂B和60 μL显色剂C显色，在酶标仪630 nm下测定显色反应吸光度 10 min，记录试验组、对照组显色反应最大速度（maxv在酶标仪中直接读取）的差值Δmaxv。

1.2.2.2标准PG样品的Δmaxv曲线

用176 mmol/L PBS（pH值为6.5）稀释标准PG样品至不同的浓度，使其酶活分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 U/mL，按照“1.2.2.1”节中的方法测定所有样品显色反应的Δmaxv。

1.2.2.3Δmaxv在96孔板中变异系数的测定

将10 μL标准PG样品与发酵液上清分别加入96孔板的所有孔中，按照“1.2.2.1”节中的方法测定所有孔中显色反应的Δmaxv，计算标准PG样品与发酵液上清在96孔板中Δmaxv的变异系数。变异系数（CV）=标准差/平均值×100%。

1.2.2.4同一菌株不同发酵时间发酵液的Δmaxv与酶活相关性分析

将产PG的Y8-10-1菌株活化后接种2%进行发酵，每隔2 h取样，苯酚次氯酸法测定酶活并读取发酵上清液显色反应的Δmaxv值，计算其与酶活的对应关系。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：取不同时间发酵液，10 000 r/min 离心5 min，取上清液，添加适量5×Loading buffer，沸水浴5 min后离心吸取上清液，采用5%浓缩胶以及12%分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.2.3NIT诱变随机诱变库的建立

pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释NIT母液至NIT浓度为0.4、0.5、0.6、1.0 mg/mL。900 μL不同浓度的NIT溶液与100 μL Y8-10-1菌液（109 CFU/mL）充分反应20 min后涂板。致死率=（未诱变平板菌落数-诱变后平板菌落数）/未诱变平板菌落数×100%；正突变率=酶活发生正突变的菌株数/发生突变的总菌株数×100%。

1.2.4诱变菌株Δmaxv值与酶活相关性分析

将NIT诱变得到的菌株，测其发酵液上清的酶活及显色反应的Δmaxv，并从中随机选取菌株计算酶活与Δmaxv之间的相关系数。

2结果与分析

2.1不同浓度PG标准品的酶活与Δmaxv的关系

将PG标准品（1.5 U/mL）稀释不同倍数，结果如表1、图1所示，可知，用PBS稀释标准PG样品不同的倍数，其不同的浓度对应的酶活分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 U/mL，将不同浓度的标准酶样品进行显色反应Δmaxv测定。结果显示，随着标准酶样品酶活的增加，Δmaxv值也在不断增加，并在酶活0～1.0 U/mL范围内，两者呈高度正相关，相关系数达到0.999，说明Δmaxv表征酶活的线性适用范围为0～1.0 U/mL，若超过1.0 U/mL，可稀释样品再进行测量。endprint

2.2在96孔板中显色反应Δmaxv变异系数的测定

96孔板在高通量菌株筛选中有着重要的地位，通过标准PG样品与发酵液在96孔板中的显色反应Δmaxv测定，结果如图2、图3、图4所示。标准PG样品在96孔板上的显色反应Δmaxv变异系数为32%（图2），并且边缘孔对应的数值均发生较大变异，说明该方法在使用过程中，96孔板在温育时受热不均匀，容易产生边孔效应[14]。使用96孔板内部60孔测定相同30组标准PG样品显色反应Δmaxv，变异系数为10%（图3），测定相同30组发酵液上清，其显色反应Δmaxv的变异系数为18%（图4），根据图1中标准PG样品的曲线，当Δmaxv变化18%时，酶活变化幅度为20%以上，说明不同样品的Δmaxv变异系数均在合理的范围内[15]，此方法每轮可筛选中酶活高于出发菌株20%的诱变株。结果表明，利用96[JP3]孔板內部60孔进行显色反应Δmaxv测定，可大大提高筛选通量。

2.3不同发酵时间对Δmaxv测定的影响

由表2以及图5可知，产PG的解阮金黄杆菌Y8-10-1随[CM（25]着发酵时间的增长，其酶活、蛋白量与Δmaxv均在增长，在[CM）]

12 h时均达到最大值，这与前人研究中的试验结果[9]一致。

在发酵初期，该菌产酶活性很低，从SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果说明，PG在发酵6 h时已有明显的目的蛋白条带出现，Δmaxv测得数值为0.004，比4 h时有着明显的提高，而苯酚-次氯酸法无法对6 h的发酵液进行准确的酶活测定，说明Δmaxv测定与苯酚-次氯酸法相比有着很高的灵敏性，并由图6可知2种方法相关性很高，r=0.991。

2.3Δmaxv测定在NIT随机诱变库中的检验

将该方法应用于NIT诱变筛选中验证其准确性，不同NIT浓度条件下的诱变结果如表3所示。

由表3可知，随着NIT浓度从0.4 mg/mL增加至 1.0 mg/mL时，致死率不断增加，当NIT浓度为1.0 mg/mL时，致死率为99.99%，而正突变率的变化呈现了先增大后减小的趋势。当NIT浓度为0.6 mg/mL时，正突变率最大，为30.4%，此结果与前期试验中对产PG的金黄杆菌诱变基本相同。综合考虑选择NIT浓度为0.6 mg/mL的[JP2]条件进行NIT化学诱变，并在建立条件过程中随机选取酶活于0～1.0 U/mL [JP]范围内的30株菌株进行酶活与Δmaxv相关性分析，结果如图7所示。

将30株酶活0～1.0 U/mL范围内的菌株发酵液测定Δmaxv，测得的Δmaxv与苯酚次氯酸盐反应测定酶活结果的相关系数r=0.890，两者呈高度正相关。此方法得到验证，可以应用于诱变初筛的阶段，大大减小了工作量。

[FK（W11][TPHC7.tif][FK）]

2.4Δmaxv测定在NIT第1轮诱变中的放大应用

以Y8-10-1作为出发菌株，利用测定Δmaxv方法进行NIT第1轮诱变初筛，结果如图8所示。

[FK（W11][TPHC8.tif][FK）]

诱变选取400株菌株进行Δmaxv值测定，对于Δmaxv大于出发菌株Δmaxv（0.038）的菌株进行苯酚-次氯酸盐法复筛，其中得到酶活大于0.6 U/mL的菌株有3株，1505120312号菌株酶活为0.81 U/mL，增加幅度最大。将这3株菌进行4次传代并摇瓶发酵测定酶活，结果如表4所示，3株突变菌体较原始菌株产酶能力均有明显的提高，其中编号1505120312的酶活提高最大，为0.73 U/mL，是亲本酶活 0.40 U/mL 的1.825倍，因此可通过本研究中建立的初筛方法在诱变初筛阶段快速有效地筛选出酶活提高的突变菌株。[FL）]

[FK（W6][HT6H][JZ]表43株初筛高酶活菌株遗传稳定性试验结果[HTSS][STBZ]

[HJ*5][BG（！][BHDFG3，WK9，WK8*2。6W]菌株编号初始酶活（U/mL）1次传代酶活（U/mL）2次传代酶活（U/mL）3次传代酶活（U/mL）4次传代酶活（U/mL）相对酶活

[BHDG1*2，WK9，WK8*2。6DWW]15051203120.810.75±0.030.77±0.070.73±0.050.73±0.0390.12%

[BHDW]15051204420.620.52±0.070.50±0.040.52±0.070.54±0.0287.10%

[BH]15051201290.630.59±0.060.48±0.070.47±0.060.49±0.0477.80%[HT][HJ][BG）F][FK）]

[FL（2K2]3结论

本试验方法利用96孔板将反应微量化缩小了反应体系，并通过高温失活酶活性，改变对照组反应条件，在酶标仪动态检测10 min下快速测定酶与底物产生氨的显色反应的Δmaxv，其与苯酚-次氯酸法测定酶活的相关系数高达0890，具有方便、快捷、通量高、试剂消耗少等优点，将该方法运用至NIT诱变中，从400株诱变菌株中获得1株是出发菌株酶活1.825倍且遗传稳定性良好的菌株，该方法在实际筛选应用中得以验证，可大大提高初筛效率，进一步用于工业育种过程。

参考文献：

[1][ZK（#]Yong Y H，Yamaguchi S，Matsumura Y.Effects of enzymatic deamidation by protein-glutaminase on structure and functional properties of wheat gluten[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（16）：6034-6040.endprint

[2]Miwa N，Yokoyama K，Wakabayashi H，et al.Effect of deamidation by protein-glutaminase on physicochemical and functional properties [JP3]of skim milk[J]. International Dairy Journal，2010，20（6）：393-399.[JP][ZK）][HT][HJ][HT][FL）][LM]

[KH*4D]

[HT8.]

[3][ZK（#]Miwa N，Nio N，Sonomoto K.Effect of enzymatic deamidation by protein-glutaminase on the textural and microstructural properties of set yoghurt[J]. International Dairy Journal，2014，36（1）：1-5.

[4]Yong Y H，Yamaguchi S，Gu Y S，et al.Effects of enzymatic deamidation by protein-glutaminase on structure and functional properties of α-zein[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（23）：7094-7100.

[5]Motoki M，Seguro K，Nio N，et al.Glutamine-specific deamidation of α S1-casein by transglutaminase[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1986，50（12）：3025-3030.

[6]Kato A，Tanaka A，Lee Y，et al.Effects of deamidation with chymotrypsin at pH 10 on the functional properties of proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1987，35（2）：285-288.

[7]Yamaguchi S，Yokoe M.A novel protein-deamidating enzyme from Chryseobacterium proteolyticum sp.nov.，a newly isolated bacterium from soil[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（8）：3337-3343.

[8]張艳芳，贾彩凤，何灿，等. 蛋白质谷氨酰胺酶产生菌的分离筛选和鉴定[J]. 食品工业科技，2015，36（1）：170-176.

[9]张艳芳. 产蛋白质谷氨酰胺酶菌株的筛选及酶的鉴定[D]. 上海：华东师范大学，2014.[ZK）]

[10][ZK（#]戚文福，王兴为，梁军，等. 苯酚次氯酸盐试剂管法测定水中氨氮[J]. 军队卫生，1984（4）：21-26.

[11]何秋云，杨志伟. 马铃薯中γ-氨基丁酸快速测定方法的研究[J]. 食品科技，2010（10）：262-266.

[12]康立. 蛋白质谷氨酰胺酶的发酵纯化及其应用的初步研究[D]. 上海：华东师范大学，2014.

[13]郭玮婷，张慧，查东风，等. 产耐高温谷氨酰胺转胺酶菌株的快速筛选方法[J]. 中国生物工程杂志，2015，35（8）：83-89.

[14]Salazar O，Sun L.Evaluating a screen and analysis of mutant libraries[J]. Directed Enzyme Evolution： Screening and Selection Methods，2003：85-97.

[15]李向红，周小玲，刘永乐，等. 蛋白质谷氨酰胺酶对米谷蛋白功能性质的影响[J]. 食品科学，2010，31（17）：192-196.endprint