成克伦 周永松 陈秀婵 熊云刚 邹阳强 姜 森 邓刘丹

（1.贵州航天医院病理科，贵州遵义563000；2.广州安必平医药科技股份有限公司技术部，广东广州510663）

FISH法对肺腺癌穿刺标本EML4-ALK融合基因的检测

成克伦1周永松1陈秀婵1熊云刚1邹阳强1姜 森1邓刘丹2

（1.贵州航天医院病理科，贵州遵义563000；2.广州安必平医药科技股份有限公司技术部，广东广州510663）

目的 探讨采用肺腺癌穿刺活检标本检测棘皮动物微管相关类蛋白4（EML4）与间变性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因（EML4-ALK）的可行性。方法 对20例肺腺癌经皮肺穿刺标本应用荧光原位杂交（FISH）法检测EML4-ALK融合基因。结果 20例标本中，19例通过FISH检测成功，检测成功率为95.00%。其中阳性2例，阳性率为10.00%。结论 肺腺癌穿刺活检标本可用作检测EML4-ALK融合基因，为靶向治疗提供参考依据。

荧光原位杂交；肺腺癌；EML4-ALK融合基因；经皮肺穿刺

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率位居恶性肿瘤之首，老年人发病比较多见。最常见的类型是鳞癌和腺癌，腺癌的发病率近年来有所上升，已占到60%左右[1]。腺癌的治疗除手术和放、化疗外，分子靶向药物应用是目前的一个热点，本研究通过FISH法，探索肺腺癌穿刺标本EML4-ALK检测的可行性，为靶向治疗作一参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集2015年1月至6月在贵州航天医院经皮肺穿刺的肺腺癌活检标本20例，镜检癌细胞数均＞50个。在20例患者中，男13例，女7例，年龄43～78岁，中位年龄61岁。实性为主性腺癌5例，腺泡为主性腺癌12例，黏液为主性腺癌2例，乳头为主性腺癌1例。高分化腺癌6例，中分化10例，低分化4例。免疫组化标记CK7全部（+），TTF-1（+）17 例，ALK（+）3 例，EGFR（+）5 例，p63 和CK5/6全部（-）。有长期吸烟史8例。

1.2 试剂：EML4-ALK融合基因检测探针试剂盒及辅助试剂均为广州安必平医药科技股份有限公司产品；免疫组化试剂为福州迈新生物技术开发有限公司产品。

1.3 方法：标本经中性福尔马林固定，石蜡包埋切片，厚4 μm。向coplin缸中加入50 mL的预处理液，加热至80℃。用缓冲液稀释蛋白酶IV，加入coplin缸中，37℃水浴。切片70℃烘烤1 h以上，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ脱水各5 min，室温风干。放入预热的预处理液中10 min，再浸于蒸馏水中5 min。放入预热的蛋白酶溶液中20 min，再浸入蒸馏水中5 min，风干。把切片放入变性液中，设定变性温度为73℃，时间5 min。将切片浸于70%、85%、无水乙醇中各1 min，风干。每张切片加10 μL探针液，盖上盖玻片进行杂交。杂交温度设定37℃，时间24 h，注意保湿。将切片浸入洗脱缓冲液I中5 min，直至盖玻片自动浮离，浸入预热至75℃的洗脱缓冲液Ⅱ中5 min。室温避光风干切片，加10 μLDAPI，盖上盖玻片，避光放置 1 min，荧光显微镜观察。

1.4 判读方法：油镜下观察至少50个肿瘤细胞。阳性细胞：红色和绿色信号分开大于等于2个信号宽度或单独的红色信号。阴性细胞：红色和绿色信号融合或分开小于2个信号宽度或只有单独的绿色信号。计数50个肿瘤细胞，＜10%为阴性，＞50%为阳性。10%～50%之间则另计数50个肿瘤细胞，2次结果相加计算百分比，＜15%为阴性，≥15%为阳性。

2 结果

20例肺腺癌穿刺标本中，19例成功通过FISH检测（3例为二次检测成功），检出成功率为95.00%，1例信号弱不能判读，详见图1。其中EML4-ALK阳性2例，阳性率为10.00%，其余为阴性，详见图2。2例阳性患者为男性，平均年龄53岁，均为中-低分化实性为主性腺癌，免疫组化 ALK（+），EGFR（-），有吸烟史。

图1 肺腺癌标本检测图

图2 肺腺癌EML4-ALK检测图（FISH×1000）

3 讨论

EML4为棘皮类动物微管相关蛋白样蛋白家族成员，其结构由N端Basic区、疏水的棘皮动物微管相关蛋白区（HELP）以及WD重复区三部分构成。EML4基因在维持细胞的基本形态方面发挥着主要作用，三部分中Basic区的作用可能最为重要[2]。ALK是一种受体酪氨酸激酶，与白细胞酪氨酸激酶（LTK）属于同一亚家族，均为胰岛素受体（IR）超家族成员，由1620个氨基酸组成该蛋白的膜外部分、跨膜区域以及膜内催化区域构成。ALK的正常生理功能尚未完全阐明，可能与神经系统的发育和功能有关[3]。EML4和ALK基因均定位于2号染色体短臂上的p21带和p23带，分布方向相反，发生融合时，其中一个需从染色体上断裂，调转方向与另一个发生融合。由于EML4具有多变的断裂位点，所以与ALK发生融合可以形成多种不同的亚型，部分亚型与肿瘤的发生发展相关[4]。最初人们将EML4-ALK融合基因看作是肺癌所特有，但随后的研究发现，在部分乳腺癌、结直肠癌以及非霍奇金淋巴瘤中也有表达，但在肺腺癌中表达最高，可达15%左右[5]。EML4-ALK融合基因的变异导致癌细胞的酪氨酸激酶异常高表达，表明它是一个新的基因靶点，针对此靶点的酪氨酸激酶抑制剂如克唑替尼（Crizotinib）在临床治疗中已取得良好疗效，所以对肺腺癌患者进行EML4-ALK融合基因检测是很有必要的。EML4-ALK融合基因检测的方法有多种，FISH法是其中一种，为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的标准方法，该检测法对确诊ALK阳性肺癌具有重要意义，缺点是不能识别融合位点，不能鉴别不同的融合变异亚型。

目前多采用手术标本对EML4-ALK进行研究，单独针对小标本的临床研究较少。本组20例肺腺癌小标本中，均经过筛选全部满足FISH方法检测条件，即100.00%的标本可用于检测。其中1例因FISH信号弱而未能获得FISH结果，FISH检测成功率为95.00%。阳性率为10.00%，与报道的手术标本的阳性率相似，虽然只有2例阳性，但患者的主要临床病理特征如年龄、病理类型和吸烟史等与有关研究符合，说明肺腺癌穿刺活检标本可用于检测EML4-ALK融合基因，尤其对中晚期腺癌更适用，因为大部分中晚期肺腺癌患者己失手术治疗机会，无法取得手术标本。但对小标本先要进行筛选，HE切片上癌细胞数量＞50个才宜于FISH检测。经皮肺穿刺的肺癌活检标本本身组织量少，经过HE切片、免疫组化以及EGFR基因检测后，量越来越少，因此一定要仔细认真合理使用标本不浪费，以保证EML4-ALK检测的正常进行，肿瘤细胞越多，检出率越高。对于肺穿刺小标本用于检测EML4-ALK融合基因，现无统一的诊断流程。由于该基因一般不与EGFR、Kras基因突变共存，从检测效能和成本的角度出发，理想的流程为对EGFR、Kras阴性的肺腺癌患者首先采用免疫组化（IHC）ALK（D5F3）抗体检查，ALK的IHC中0分和3+者可暂不作FISH检测，1+和2+者作FISH检测更合适，必要时也结合临床和病理特征作选择。

肺穿刺小标本EML4-ALK融合基因的检测成功率与严密的操作步骤密切相关，本实验中有3例是二次检测成功的也证明了这一点。由于目前检测成本较高，所以每一步都要一丝不苟去做，争取一次性成功检测。

［1］ 梁小龙，王孟昭，张静，等.检测肺腺癌活检标本间变性淋巴瘤激酶蛋白表达和基因融合［J］.中华肿瘤杂志，2014，36（7）：501-504.

［2］ 张邢松，魏万里.肺癌组织中EML4-ALK基因表达的研究进展［J］.现代肿瘤医学，2014，22（5）：1226-1230.

［3］ 郭易楠，岳文涛.EML4-ALK融合基因在肿瘤中的研究进展［J］.国际肿瘤学杂志，2014，41（7）：484-487.

［4］ Sasaki T，Rodig SJ，Chirieac LR，et al.The biology and treatment of EML4-ALK non-small cell lung cancer［J］.Eur J Cancer，2010，46（10）：1773-1780.

［5］ 王梦，杨继元，李军川，等.EML4-ALK在非小细胞肺癌中的表达及临床意义［J］.临床肿瘤学杂志，2013，18（8）：688-690.

［6］ Gridelli C，Peters S，Sgambato A，et al.ALK inhibitors in the treatment of advanced NSCLC［J］.Cancer Treat Rev，2014，40（2）：300-306.

Detection of EML4-ALK Fusion Gene in Lung Adenocarcinoma Specimens By FISH

Cheng Kelun1Zhou Yongsong1Chen Xiuchan1Xiong Yungang1Zou Yangqiang1Jiang Sen1Deng Liudan2
（1.Department of Pathology，Guizhou Aerospace Hospital，Zunyi 563000，China；2.Department of Polytron Technologies Inc，Guangzhou LBP Medical Technology，Guangzhou 510663，China）

ObjectiveTo test the feasibility of detecting echinoderm microtubule related protein 4 （EML4）and anaplastic lymphoma kinase（ALK）fusion gene（EML4-ALK）in lung adenocarcinoma biopsy samples.Methods Fluorescence in situ hybridization（FISH）was performed for 20 lung adenocarcinoma biopsy samples to detect EML4-ALK fusion gene.Results FISH assay was successful for 19 of the 20 samples，with a success rate of 95%.2 of the 20 cases（10%）was positive for EML4-ALK fusion gene.Conclusion Lung adenocarcinoma biopsy specimens can be used for detection of EML4-ALK fusion gene，which provides references for targeted therapy of this disease.

Fluorescence in situ hybridization；Lung adenocarcinoma；EML4-ALK fusion gene；Percutaneous aspiration lung

R734.2

A 学科分类代码： 32067

1001-8131（2017）04-0314-03

2017-02-04

中国航天科工集团公司医疗卫生科研项目（2014-LCLX-009）