王荣琼 宋海洋 霍海龙 彭 洁 刘永张 杨玉钊 邹丰才 杨建发*

试验研究

豪猪蛲虫18s rDNA序列分析

王荣琼①宋海洋②霍海龙①彭 洁①刘永张③杨玉钊③邹丰才②杨建发②*

（①云南农业职业技术学院 云南 昆明 650212 ②云南农业大学动物科学技术学院 云南 昆明③云南省昆明动物园 云南 昆明）

为了鉴定从昆明动物园豪猪消化道检获的某线虫种类，采取保守引物扩增虫体的18s rDNA序列，通过测序获得892bp的有效序列，通过在线Blast对比分析，结果显示，与GenBank上公布的尖尾科啮齿类动物的Wellcomia siamensis，Protozoophaga obesa，Protozoophaga obesa，Enterobius sp.序列EF180079.1、EF180075.1、EF180066.1、KJ768610.1，相似度分别为93%、88%、87%、84%。对比分析表明，所检获的豪猪消化道线虫为蛲虫，这为豪猪寄生虫病防治提供了依据，为豪猪蛲虫后续的研究奠定了基础。

豪猪 蛲虫 18s rDNA

豪猪是一种经济价值较高的野生动物，不仅具有较高的食用价值，而且还具有很高的药用价值，由于其饲养方法简单，在国内部分地区已经进行了人工养殖，并取得了一定的经济效益[1]。由于饲养管理卫生不良等因素的影响，导致豪猪疾病时有发生。目前关于豪猪的疾病报道主要有急性肺炎和肠炎[2]。寄生虫病也是影响动物生长和健康的主要疾病之一。明确动物所感染寄生虫的种类对寄生虫病的防治具有重要参考价值。

分子生物学技术已广泛用于寄生虫虫种的鉴定，核糖体DNA(rDNA)中的18s、5.8s以及28s的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在不同寄生虫种间变异差性较大，是寄生虫虫种鉴定的主要参考基因序列[3-6]。本试验对豪猪消化道检获的蛲虫rDNA中的18s rDNA进行PCR扩增分析和对比分析，以此确定其种属关系。

1 材料与方法

1.1 虫体样本 虫体样本来自云南省某动物园豪猪粪便中检获的线虫，用灭菌生理盐水洗净后，保存于70%酒精中备用。

1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒为天根公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒；DNA胶回收试剂盒为天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒；Trans2K DNA Marker为TransGen Biotech公司产品；PCR试剂均为TaKaRa宝生物工程 (大连)有限公司产品。

1.3 虫体DNA提取 取单个虫体，用灭菌双蒸水吹打冲洗3次后，置于灭菌的1.5ml的eppendorf管中，用灭菌小剪刀将虫体剪碎，再用少量灭菌水中浸泡20～30min，按照试剂操作步骤提取虫体的DNA。

1.4 虫体18S rDNA扩增 参照文献[5]引物序列18SF：GAGGAGGTAGTGACGAAT和18SR：GGACATCTAAGGGCATC由上海生工合成，PCR扩增体系为25μl，其中10×PCR Bufer(Mg2+free)2.5μl，25mM MgCl22.0μl，dNTPs(2.5mM each)0.5μl，ddH2O 16.8μl，上下游引物(50pmol/μl)各0.5μl，rTaq DNA聚合酶(5U/μl) 0.2μl，模板DNA 2μl。反应条件为94℃预变性5min，后94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸5min。

1.5 测序分析 采用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，并送至上海生工公司进行测序，然后对结果进行比对分析。

2 结果

2.1 PCR产物电泳 PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，所得片段与预期片段大小一致(图1)。

图1 PCR产物电泳图

2.2 测序和分析 测序获得豪猪蛲虫18SrDNA有效序列大小为892bp，如下所示。CGAATGATGAGCTGATTATG TGCTGCGCATCGATGCCCACAGATGTAACGAGGATCT ATGAGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TTCCAGCTCTTATAGTGTATATCGTTACTGCTGCGGTT AAAAAGCTCGTAGTTGGATCTGCATTCAAGCTCTTGG TCCACCAATTTTGGTGCTGAACCAAGTTTATTTTTGG CTTGAACAATAATTAATGCTGGTTTTTTTTTTGCTATAGGTTACCTTTATTGGTCCCCTATAGTGGCTGGCAAGTT TACTTTGAAAAAAGTAAAGTGATTAAAGCAGGCTATT TTTGCCTGAATAATGGTGCATGGAAAAATGAAATAGG ATCTCGATTCTATTTTGTTGGTTTTCTGAATTGAAATA ATGATTAAAAGGGACAAACGGGGGCATTCGTATCGCT GCCCGAGAGGGGAAATTCTGGGACCGTAACGAGACC CCCAACTGCGAAAGCATTTGCCAAGAATGTTTTCATT AATCAAAAACGAAAGTCAAAGGTTCGAAGGTGATCA AATACCGCCCTAGTTCCGACCGTAACGATACCAACTA GCGTTCCGCCTTGGCGTTTTGCTTAGGCGGCAGCTTC CGGAACGAAGTTTTCGGTCCGGGGGGATATGGTTGC AAGCTGAACTTAAGAATTGACGGAGGCACCACAGGA GTGGAGCCTGCGCTTATTTGACTCAACACGGAATCTC ACTGGCCAGACCCGTAAGATTGACGATTGAAGCCTC ATGATTGTGATTGTGGCATGGTCGTCTAGTGTGATGAT GTGCTATCGATACGACGGACTAGCTACTATGTATGATA TTCGATTCAATACTCTAAGCAGCACATAGCGCGAAAC ATACAGTTGAGTCCTACCTCA。将序列进行在线Blast比对分析，该序列与GenBank上公布的尖尾科的Wellcomia siamensis，Protozoophaga obesa，Protozoophaga obesa，Enterobius sp. 序列EF180079.1、EF180075.1、EF180066.1、KJ768610.1，相似度分别为93%、88%、87%、84%，该结果表明所检获的豪猪消化道线虫为尖尾科蛲虫。

3 讨论

从豪猪消化道检获的线虫通过分子检测，发现其18S rDNA序列与啮齿目动物鼠蛲虫相似，豪猪同属啮齿目动物，序列对比分析结果表明豪猪感染的消化道寄生虫属于尖尾科蛲虫。蛲虫是啮齿类动物的重要线虫，寄生于啮齿类动物的结肠和盲肠内，部分种属的蛲虫也是一种常见人兽共患寄生虫，常的寄生于儿童的肠道寄生虫[7,8]，轻度感染时无明显临床症状，严重感染时可见肠炎、直肠脱、肠套叠及消瘦等症状[8]。目前关于蛲虫寄生于除人以外动物上的报道大多是关于实验类小鼠[9,10]，野生动物感染蛲虫的报道较少，本文对豪猪蛲虫的鉴定和序列分析尚属首例，这为豪猪寄生虫病的防治奠定了基础。

目前云南地区的豪猪养殖场多以农村小规模的养殖为主，动物园饲养的豪猪是用于观赏。豪猪的饲料以农产品为主，如南瓜，玉米，红薯，蔬菜和水果等，豪猪的饲养相对较为粗放，野鼠乱窜，污染豪猪的饲料和圈舍的可能性极大，这势必增加了豪猪感染蛲虫机会。

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S852.73

A

1007-1733(2017)09-0001-02

2017–04–26）

云南省教育厅基金（2016ZZX257）；福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室开放基金（2016KL01）。

*通讯作者