朱冲冲 彭 冰 曾祖平 韩旭阳 王 宏 王天园

(首都医科大学附属北京中医医院北京市中医研究所，北京，100010)

中药研究

香鳞毛蕨95%乙醇提取物的急性毒性研究

朱冲冲 彭 冰 曾祖平 韩旭阳 王 宏 王天园

(首都医科大学附属北京中医医院北京市中医研究所，北京，100010)

目的：探讨香鳞毛蕨95%乙醇提取物对小鼠的急性毒性。方法：采用健康昆明种小鼠，灌胃给予香鳞毛蕨95%乙醇提取物，给药剂量范围为10.00 g/kg～24.00 g/kg，观察小鼠中毒症状并记录死亡动物情况，采用Bliss法测定半数致死量(LD50，Median Lethal Dose)；灌胃给予香鳞毛蕨95%乙醇提取物，给药剂量分别为32 g/kg、16 g/kg、8 g/kg，对各组小鼠进行生化检查和病理组织形态学检查。结果：香鳞毛蕨95%乙醇提取物的小鼠LD50为13.53 g/kg；病变部位为心肌凝固性坏死，肾皮质、髓质内可见肾小管变性坏死脱落，肝细胞轻度浊肿，空泡变性，脾脏及肺脏等未见明显病变。结论：香鳞毛蕨95%乙醇提取物具有一定的毒性。

香鳞毛蕨；急性毒性；LD50

香鳞毛蕨Dryopterisfragrans(L.)Schott是鳞毛蕨科Dryopteridaceae鳞毛蕨属DryopterisAdans.植物，多生长于高寒地区的滑石坡、森林中的碎石坡和火山周围的岩浆缝隙中，主要分布于我国东北、华北各省，俄罗斯、日本、朝鲜以至欧洲、北美洲亦都有分布[1]。间苯三酚类化合物是鳞毛蕨属植物的特征性化学成分，也是产生药理活性的主要成分，有研究发现香鳞毛蕨95%乙醇提取物中间苯三酚类含量最高[2-3]。范华倩[2]等发现香鳞毛蕨95%乙醇提取液中间苯三酚含量最高，且对红色毛癣菌、犬子孢子菌等有一定的抑制作用。樊锐锋等[4]发现间苯三酚类衍生物含量越高，香鳞毛蕨提取物抑菌效果越好。

香鳞毛蕨的化学成分结构类型主要有间苯三酚类、萜类、黄酮类等。目前对香鳞毛蕨的生物活性研究主要集中在抗肿瘤[5-9]、抗菌[10-14]、抗氧化[15]、抗炎[16]及治疗皮肤病[17]等方面，未见对其毒性研究的报道。本课题前期实验中发现香鳞毛蕨水提物和香鳞毛蕨30%乙醇提取物对小鼠无毒性，其60%乙醇提取物及95%乙醇提取物对小鼠有一定的毒性，且95%乙醇提取物毒性相比60%乙醇提取物毒性更大，因此，本研究进行了对香鳞毛蕨95%乙醇提取物的急性毒性研究，为其安全合理使用提供一定依据。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康昆明种小鼠，雌雄各半，18～22 g，由中国食品药品检定研究院提供，动物许可证编号SCXK(京)20140013。小鼠在SPF级动物室适应性饲养2 d，自由摄食、饮水，室温22～26 ℃，湿度30% ～50%。

1.1.2 药物 香鳞毛蕨采自黑龙江省五大连池地区，由北京中医药大学中药学院高增平教授鉴定为Dryopterisfragrans(L.)Schott，凭证标本(DF0110801)保存于北京市中医研究所。

取香鳞毛蕨粗粉适量，加12倍95%乙醇，浸0.6 h，超声提取0.6 h，抽滤，减压浓缩至无醇味，加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液制成含生药2 g/mL的混悬液，依次稀释得各浓度混悬液。

1.1.3 试剂与仪器 羧甲基纤维素钠(F20070608，国药集团化学试剂有限公司)；尿素氮(BUN，20160526，英科新创(厦门)科技有限公司)；谷丙转氨酶(ALT，20160526，英科新创(厦门)科技有限公司)；谷草转氨酶(AST，20160526，英科新创(厦门)科技有限公司)；肌酐(CR，20160615，北京科美生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 60只健康昆明小鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半，分别为：空白对照组，香鳞毛蕨95%乙醇提取物24.00 g/kg组，19.20 g/kg组，15.36 g/kg组，12.29 g/kg组，10.00 g/kg组。采用Bliss计算半数致死量(LD50)及95%可信区间。

40只健康昆明小鼠水机分为4组，每组10只，雌雄各半，分别为：空白对照组，香鳞毛蕨95%乙醇提取物32 g/kg组(H)，16 g/kg组(M)，8 g/kg组(L)。进行组织病理学检查和血清生化检测。

1.2.2 给药方法 实验前禁食不禁水16 h，次日上午灌胃给药1次，按体积40 mL/kg小鼠体重灌胃。空白对照组灌胃等量0.5%羧甲基纤维素钠溶液，其他各给药组分别灌胃各对应浓度药物，常规饲养，连续观察8 d，记录动物反应及死亡情况。

1.2.3 取材与检测方法 对死亡的动物及时进行解剖尸检，肉眼观察各脏器，记录病变情况。取其心、肝、脾、肺、肾脏，经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下进行形态足学检查；

未死亡小鼠取血，37 ℃静置0.5 h，低温离心(10 min，3 000 r/min)，取上清液，上清液中检测BUN、CR、ALT、AST含量。

1.3 统计学方法 运用SPSS 17.0软件，对数据做正态性检验和方差齐性检验，两项均符合，采用单因素方差分析进行统计计算。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 香鳞毛蕨95%醇提物组毒性反应 灌胃给药后，95%醇提物组小鼠活动明显减少，出现倦怠、呼吸加速、反应迟钝、运动失衡等症状，10 min后小鼠开始出现死亡，小鼠死亡多集中在0.5～1 h，所有死亡小鼠均在给药当天死亡，且死亡前大多伴阵发性抽搐。给药第2天以后未发现小鼠死亡，未死亡小鼠与空白组小鼠相比呈现较明显抑制状态，随时间延长小鼠饮食、体重逐渐恢复正常。

2.2 香鳞毛蕨95%乙醇提取物组LD50及95%可信区间 根据各剂量组小鼠累计死亡数及给药剂量，采用Bliss法计算香鳞毛蕨95%醇提物组LD50及95%可信区间。见表1。香鳞毛蕨95%乙醇提取物的小鼠LD50为13.53 g/kg，95%可信区间为11.971～15.155 g/kg。

表1 香鳞毛蕨95%乙醇提取物对小鼠LD50测定结果

注:“—”表示无数据

2.3 血清生化检查 对香鳞毛蕨95%乙醇提取物组小鼠和空白对照组小鼠血清进行生化检查发现，95%醇提物中剂量组小鼠血清中ALT、BUN与空白组小鼠比较差异有统计学意义，低剂量组小鼠血清与空白组比较差异无统计学意义，而95%乙醇提取物组小鼠血清中AST、CR与空白组小鼠比较差异均无统计学意义。见图1。

图1 各组小鼠血清生化指标

注:“C”：空白对照组；“L”：香鳞毛蕨95%乙醇提取物低剂量组；“M”：香鳞毛蕨95%乙醇提取物中剂量组“*”：P<0.05

2.4 组织病理学检查 各组动物的脾脏、肺脏等脏器均未见明显病变：白髓淋巴组织脾小结明显，外部边缘区淋巴细胞增生，红髓髓索清楚，其间髓窦充满红细胞并伴多核巨细胞增生；肺池壁毛细血管充有红细胞。各级支气管周围间质有肺动、静脉、淋巴组织和疏松结缔组织。肺泡充气良好。香鳞毛蕨95%乙醇提取物组小鼠心肌凝固性坏死；肝细胞轻度浊肿，空泡变性，并可见出血坏死；肾皮质、髓质内可见肾小管变性坏死脱落，肾小血管周围炎细胞浸润。见图2。

图2 香鳞毛蕨急性毒性病理切片(物镜100×)

注：A.空白对照组心脏；B.空白对照组肝脏；C.空白对照组肾脏；D.香鳞毛蕨95%醇提物高剂量组(32.00 g/kg)，箭头指示为心肌凝固性坏死；E.香鳞毛蕨95%醇提物高剂量组(32.00 g/kg)，箭头指示为肝出血坏死；F.香鳞毛蕨95%醇提物高剂量组(32.00 g/kg)，箭头指示为肾小管变性坏死脱落

3讨论

香鳞毛蕨95%乙醇提取物急性毒性实验中，与空白组小鼠比较，各给药组小鼠均出现活动减少，呆滞，运动失衡，呼吸加速等中毒症状，说明香鳞毛蕨95%乙醇提取物有一定的毒性，灌胃给药后的LD50为13.53 g/kg，95%的可信限为11.971～15.155 g/kg，根据化学物质急性毒性剂量分级表可知，香鳞毛蕨95%乙醇提取物灌胃给药分级为微毒。

研究结果显示：单次大剂量给药香鳞毛蕨95%乙醇提取物可引起小鼠心肝肾急性损伤，长期给药是否会造成蓄积损伤及损伤是否可逆还不明确。课题组对香鳞毛蕨95%乙醇提取物进行急性毒性研究，可对今后用药有一定指导意义。但是目前香鳞毛蕨毒性物质基础、体内毒性过程、毒性作用特点、毒性作用机制尚不明确，仍有待进一步研究。课题组对香鳞毛蕨95%乙醇提取物进行急性毒性研究，对其新药研发有一定指导意义。

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(2016-09-14收稿 责任编辑：徐颖)

AcuteToxicityof95%EthanolExtractsfromDryopterisfragrans(L.)Schott

Zhu Chongchong, Peng Bing, Zeng Zuping, Han Xuyang, Wang Hong, Wang Tianyuan

(BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China)

Objective:To study the acute toxicity of 95% ethanol extracts from Dryopteris fragrans (L.) Schott in mice.Methods:The Dryopteris fragrans 95% ethanol extracts were given to the healthy Kunming mice by intragastric administration. The dose range of 95% ethanol extracts were 10.00 g/kg～24.00 g/kg. The movement and toxic symptoms were observed and the number of dead mice were recorded. LD50were calculated by Bliss′ method. Pathological changes were examined by pathological section.Results:LD50of the 95% ethanol extracts were 13.53 g/kg, respectively. Pathological section indicated that the myocardial coagulation necrosis, renal tubular degeneration and necrosis, and mild swelling of liver cells, vacuole degeneration, while other organs such as the spleen and lung were with no significant pathological changes.Conclusion:The 95% ethanol extracts of Dryopteris fragrans possesses certain toxicity.

Dryopteris fragrans (L.) Schott; Acute toxicity; LD50

R285；R282.71

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.048

北京市自然科学基金项目(7144200)

朱冲冲(1990.01—)，男，硕士研究生，研究方向：中药化学，E-mail：1004410653@qq.com

彭冰(1978.04—)，男，博士，副研究员，研究方向：中药药效物质及质量标准研究，E-mail：pengbing126@126.com