王嘉麟 邢 佳 贺立娟 朱晓晨 王椿野 王 蕊 郑建颖 张 迎 李秋祥 崔洪志 秦裕驹 符海燕 高 维 郭 晓 袁清洁 高东阳 郭凯航 王建伟 王玉来 郭蓉娟

(北京中医药大学东方医院，北京，100078)

益气活血药物对脑梗死恢复期大鼠c-fos基因表达的影响

王嘉麟 邢 佳 贺立娟 朱晓晨 王椿野 王 蕊 郑建颖 张 迎 李秋祥 崔洪志 秦裕驹 符海燕 高 维 郭 晓 袁清洁 高东阳 郭凯航 王建伟 王玉来 郭蓉娟

(北京中医药大学东方医院，北京，100078)

目的：基于c-fos mRNA观察益气活血药物对脑梗死恢复期大鼠的影响。方法：以Longa的方法略作改良制作大鼠左侧大脑中动脉阻塞模型，按照随机数字表的方法随机分为正常组、模型组、假手术组、益气组、活血组、益气活血组、ERK抑制剂7组，采用RT-PCR技术，在治疗28 d观察益气活血药物对脑梗死恢复期大鼠梗死皮层c-fos mRNA表达的影响。结果：在治疗28 d后，模型组较正常组c-fos mRNA表达明显下降(P<0.05)，益气活血组与ERK抑制组较模型组有一定程度提高(P<0.05)，活血组与模型组比较，无明显统计学意义(P>0.05)，益气组的c-fos mRNA表达低于其他各组(P<0.05)。结论：在脑梗死恢复期，益气活血药物在一定程度上可改善脑缺血，优于单纯益气与单纯活血，其疗效机制可能与提高c-fos mRNA的表达有关。

脑梗死；c-fos；益气活血

脑梗死是一种严重危害人类健康的常见难治性疾病，寻求有效的防治方法一直是脑梗死研究领域的热点课题。益气活血中药在脑梗死恢复期的治疗中起到重要价值，然而其疗效的分子机制尚不清楚，为此设立本研究。通过比较单纯益气及单纯活血药物，于梗死28 d观察益气活血药物对脑梗死恢复期大鼠的c-fos基因的影响，从分子生物学水平揭示益气活血药物治疗脑梗死恢复期的疗效机制，为益气活血药物治疗脑梗死恢复期的应用提供科学依据。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SPF级Wistar大鼠42只，体重(207～238)g，平均(219.84±6.72)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2015-0001。饲养在SPF环境下，术前12 h禁食，不禁水。

1.1.2 药物 活血药：注射用血栓通(冻干)(三七总皂苷)(广西梧州制药集团股份有限公司，批准文号：国药准字Z20025652，生产批号：14052406)。益气药：黄芪注射液(正大青春宝药业有限公司，批准文号：国药准字Z33020179，生产批号：1409051)。益气活血药：注射用血栓通(冻干)+黄芪注射液。ERK抑制剂：U0126(Sigma)。

1.1.3 试剂与仪器 1)试剂：TRNzol总RNA提取试剂(北京天根生化科技有限公司)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)、SYBR®Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)，ROX plus(TaKaRa公司)、DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)、引物合成(Invitrogen)。2)主要仪器：涡旋振荡仪(QL-902)(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、离心机(Centrifuge 5415D)(Eppendorf)、分光光度计(NANODROP 2000)(Therno scientific)、荧光定量PCR仪(ABI7500)(Applied Biosystems)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 1)分组：按照随机数字表法，将大鼠分为7组：正常组、假手术组、模型组、ERK抑制组、单纯活血组、单纯益气组、益气活血组，每组6只，由于本研究观察时点较长，部分大鼠因进食困难等因素而死亡，因此，每组实际完成研究的例数为3只。2)模型制备方法：以Longa的方法略作改良，制作线栓阻塞大鼠左侧大脑中动脉模型，同时按照Bederson评分观察术后动物的神经症状和体征[1]。

1.2.2 给药方法 各组均在脑梗死造模后开始给药。中药各组给予相应中药注射剂腹腔注射，1次/d，连续给药28 d，其中活血组给予血栓通注射液0.45 g/(kg·d)(配比浓度0.03 g/mL，平均给药3.3 mL)，1次/d，益气组给予黄芪注射液60 g/(kg·d)(配比浓度2 g/mL，平均给药6.6 mL)，1次/d，益气活血组给予黄芪注射液联合血栓通注射液，1次/d，剂量同上2组。假手术组与模型组给药时间和途径同中药组，以蒸馏水代替药液。ERK抑制组：予ERK抑制剂U1026腹腔注射(0.1 mg/(kg·d)，1次/d)(配比浓度0.01 mg/mL，平均给药2.2 mL)

1.2.3 检测指标与方法 1)检测指标：各组大鼠梗死皮层的c-fos mRNA的表达；2)检测方法：RT-PCR法检测，引物在北京Invitrogen公司合成，c-fos上游引物序列CCGAAGGGAAAGGAATAAGATG，c-Fos下游引物序列GGGCTGCCAAAATAAACTCC，PCR扩增片段长度大小173bp；内参GAPDH上游引物序列CCTTCCGTGTTCCTACCCC，GAPDH下游引物序列GCCCAGGATGCCCTTTAGTG，PCR扩增片段长度大小131 bp。采用通用方法[2]提取总RNA、反转录cDNA、RT-PCR扩增及检测。按照2-△△ct相对定量计算公式:

F=2[(待测目的基因平均Ct值-待测组管家基金平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值)]

计算出相对于对照样品，各组目的基因mRNA转录水平的差异。

1.3 统计学方法 将获得的实验数据输入excel数据库，以均数±标准差来表示，采用SPSS 20.0软件作统计分析，计量资料组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义，以P<0.01为差异有显著统计学意义。

2结果

2.1 各组一般情况观察 造模前，各组大鼠健康状况相同；毛色光亮、顺滑；行动、饮食、饮水、排泄均正常。造模后，各组大鼠在苏醒后即刻观察，其中假手术组大鼠一般状况可，毛色光亮，受伤口影响，行动缓慢，进食、饮水、排泄正常。而模型组等其他各组大鼠一般状况较差，形体消瘦，进食量明显减少，毛色黄暗，被毛不顺滑，出现右侧肢体偏瘫、转圈、不能直立，身体向右侧倾倒，或者在原地向右侧转圈、追尾等，评分在1～3分，不能自主到食盒内采食，不能自主饮水，需要人为辅助喂食喂水。给药28 d后，中药各组、ERK抑制组大鼠偏瘫症状均好于模型组。

2.2 各组脑梗死恢复期大鼠c-fos mRNA表达比较(RT-PCR法)以正常组的平均△CT值4.445作为对照样本，治疗28 d后，c-fos mRNA表达趋势：正常组与假手术组>抑制组与益气活血组>模型组与活血组>益气组，即模型组较正常组c-fos mRNA表达明显下降(P<0.05)，益气活血组与ERK抑制组较模型组有一定程度提高(P<0.05)，活血组与模型组比较，无明显统计学意义(P>0.05)，益气组的c-fos mRNA表达低于其他各组，提示益气活血药物在一定程度上可提高c-fos mRNA的表达，好于单纯益气及单纯活血，与ERK抑制组的疗效大致相当，但仍未恢复至正常。见表1。

表1 各组对脑梗死恢复期大鼠c-fos mRNA表达的影响比较(n=3)

3讨论

脑梗死是严重危害人类健康的重大疾病，许多患者在急性期过后，常常留有肢体瘫痪、言语障碍、吞咽困难、二便失控、生活难以自理等症状，这给患者带来极大的痛苦及悲观情绪，甚至丧失生活信心，针对脑梗死具有较高的致残率和复发率，探讨脑梗死恢复期有效的治法，促进脑梗死患者的康复，提高其生命质量，显得非常重要。脑梗死属于中医“中风病”范畴，病理性质属本虚标实，急性期多以痰、瘀实证的表现为主，而恢复期则多表现为虚(气虚、阴虚)、瘀，益气活血法成为重要治法，王清任创立了中风病气虚血瘀理论，他在《医林改错》中说：“半身不遂，亏损元气，是其本源”“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”，提示脏腑气血的运行均有赖于元气的推动，气无则血无以依附。久病或脏腑衰竭，造成元气虚弱，气虚鼓动无力，不能帅气正常运行于脉中，而变成瘀血。采用益气活血代表方剂——补阳还五汤治疗中风偏瘫，至今仍有很高的立论和临床指导意义，备受后世医家推崇。益气活血法成为脑梗死恢复期的经典治法，大量研究证实其有效性[3-4]。

益气活血中药治疗脑梗死有确切疗效，但是其疗效机制非常复杂，这与脑梗死病理机制庞杂以及中药本身具有多水平、多通道、多靶点的效应有关。例如，益气活血法可促进脑缺血再灌注大鼠的血管新生，改善脑循环[5]，参与调节Notch通路[6]及Wnt信号通路[7]，其中黄芪注射液[8]还可使脑缺血再灌注大鼠的神经营养因子表达。丝裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinases，MAPKs)是细胞内的至关重要的蛋白激酶。研究证实，MAPK信号转到通路存在于大多数细胞内，将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)的过程中具有至关重要的作用。MAPK可分为3个主要的亚群，即细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK)，应激活化蛋白激酶(JNK)和p38MAPK。其中，ERK1/2在细胞信号转导通路中起主要作用。ERK1/2由2种同工异构体组成，分别为ERK1和ERK2，两者在体外有相同的作用底物，两者在功能上的重叠。活化的ERK形成二聚体，转入细胞核，磷酸化其他转录因子如癌基因c-fos、c-jun等而调控基因表达，参与细胞的增殖、存活、分化、凋亡、炎性反应和氧化应激等。c-fos是ERK下游的转录因子之一，正常情况下，在神经元中呈极低水平表达，但其作为细胞核的“第三信使”，通过启动和调控某些具有特殊功能意义的靶基因的表达，对神经元的生长、分化、再生和重塑起着举足轻重的作用。研究发现，c-fos的表达与脑缺血缺氧后神经元的信息传递、凋亡密切相关。脑缺血缺氧后即快速而短暂的诱导表达。c-fos的表达参与了脑缺血耐受,是脑缺血耐受的保护机制之一。c-fos蛋白的积累说明缺血后神经元蛋白质合成能力的快速恢复，并可能在学习记忆过程中起到重要作用[9-10]。也有学者认为c-fos参与脑缺血的损伤[11-15]。

本研究发现，在治疗28 d时，模型组的c-fos mRNA表达量较正常组明显下降，而经过益气活血药物治疗后，呈现上升趋势(见表1)，这提示在脑梗死恢复期中，c-fos本身参与脑缺血的保护作用，这与部分学者[16]的结果相一致，益气活血药物的疗效机制之一是提高c-fos mRNA的表达。

本研究的不足之处，每组样本量较小，需要在今后的实验中扩大样本量进行验证，不妥之处望同行指正。

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(2016-09-13收稿 责任编辑：徐颖)

EffectofSupplementingQiandActivatingBloodCirculationDrugsonC-FosMrnaofRatswithCerebralInfarction

Wang Jialin，Xing Jia，He Lijuan，Zhu Xiaochen，Wang Chunye，Wang Rui，Zheng Jianying，Zhang Ying，Li Qiuxiang， Cui Hongzhi，Qin Yuju，Fu Haiyan， Gao Wei，Guo Xiao，Yuan Qingjie，Gao Dongyang，Guo Kaihang， Wang Jianwei，Wang Yulai，Guo Rongjuan

(DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China)

Objective:To observe the expression of c-fos mRNA of rats with cerebral infarction in recovery period under supplementing qi and activating blood circulation drugs.Methods:Longa method was slightly modified in making the rat model of left middle cerebral artery occlusion. According to the random number table method，the rats were randomly divided into 7 groups，including a normal group, a model group, a sham operation group, a supplementing qi group, an activating blood circulation group, a supplementing qi and activating blood circulation group, and an ERK inhibitor group. Using RT-PCR technique, we observed the effect of supplementing qi and activating blood circulation drugs on c-fos mRNA of rats with cerebral infarction after 28 days′ treatment in myocardial infarction cortex.Results:After 28 days′ treatment，compared with normal group, c-fos mRNA expression in the model group was significantly decreased (P<0.05)；c-fos mRNA expression in the supplementing qi and activating blood circulation group and ERK inhibition group increased to a certain extent than that in the model group (P<0.05)；the activating blood circulation group had no significant statistical difference with the model group(P>0.05)；c-fos mRNA expression in supplementing Qi group was lower than the other groups (P<0.05).Conclusion:In the recovery period of cerebral infarction, supplementing qi and activating blood circulation drugs can improve cerebral ischemia in a certain degree, which is better than simply supplementing qi and activating blood circulation, and its therapeutic mechanism may be related to improving the expression of c-fos mRNA.

Cerebral infarction; C-fos; Supplementing qi and activating blood circulation

R256

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.043

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2015CB554401)；高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(20120013120014)；北京中医药大学东方医院人才培养计划项目(东方新星)(DFRC2014C01)

王嘉麟(1982.04—)，男，医学博士，副主任医师，硕士研究生导师，研究方向：中西医结合防治脑病基础与临床研究，E-mail:WJL2008420@sina.com，Tel：(010)67689749

郭蓉娟(1964.08—)，女，医学博士，主任医师，博士研究生导师，北京中医药大学东方医院副院长，研究方向：中西医结合防治脑病基础与临床研究，Tel：(010)67689749，E-mail:dfguorongjuan@163.com