张北华 王 微 王凤云 唐旭东

(1 中国中医科学院西苑医院，北京，100091； 2 北京市中西医结合医院，北京，100039)

实验研究

基于不同精神心理应激建立IBS-D大鼠模型的比较研究

张北华1王 微2王凤云1唐旭东1

(1 中国中医科学院西苑医院，北京，100091； 2 北京市中西医结合医院，北京，100039)

目的：比较基于母子分离、慢性束缚等不同精神心理应激建立IBS-D大鼠模型的特征差异，探索建立IBS-D大鼠模型的理想方法。方法：将40只新生期SD大鼠随机分为母子分离组和非母子分离组，每组20只，母子分离组大鼠第2～14天每天与母鼠分离3 h，其余大鼠不分离。第9周，将非母子分离组随机分为正常组(N组)、慢性束缚组(R组)，将母子分离组随机分为单一母子分离组(S组)和联合应激组(SR组)，每组10只。R组和SR组大鼠采用自制束缚架进行制动束缚应激，3 h/d，连续3周，其余2组不予束缚。在束缚期的最后1周，N组大鼠予生理盐水灌胃，其余3组大鼠均予番泻叶煎剂(0.45 g/mL)灌胃(4.5 g/kg)，连续7 d。检测评价4组大鼠成年期束缚应激前后内脏敏感性、大便积分、旷场行为学，以及造模后血清5羟色胺水平、近端结肠常规病理、肥大细胞及嗜铬细胞数量。结果：1)内脏敏感性：束缚应激前，经历母子分离应激组(S组、SR组)大鼠痛觉阈值明显低于非母子分离应激组(N组、R组)(P<0.05)；束缚应激后，S组和SR组大鼠痛觉阈值显著低于N组(P<0.05)，R组与N组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。2)大便积分：S组、R组及SR组大便积分均明显高于正常组(P<0.05)，SR组明显高于R组和S组(P<0.05)。3)旷场行为学特征：束缚应激前，S和SR组大鼠旷场穿格数有低于N和R组的趋势，但站立数均明显低于N和R组(P<0.05)；束缚应激后，R组、S组、R组大鼠旷场穿格数及站立数均明显低于N组(P<0.05)，SR组穿格数明显低于S组(P<0.05)。4)血清5-HT水平：S组和SR组大鼠血清5-HT水平明显高于N组(P<0.05)，R组与N组差异无统计学意义，SR组明显高于S组和R组(P<0.05)。5)近端结肠病理及MC、EC数目：4组大鼠结肠病理未见异常。SR组大鼠近端结肠MC数目明显多于N组(P<0.05)，其余各组与N组差异无统计学意义。S组、R组及SR组结肠嗜铬细胞数目均明显高于N组(P<0.05)，SR组与S组和R组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论：基于母子分离联合慢性束缚应激及番泻叶灌胃可复制IBS-D大鼠模型，该模型具有内脏敏感性增高、排便异常和抑郁样行为特征。

腹泻型肠易激综合征；造模方法；精神心理应激；比较研究

肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是一种以反复发作的腹痛，与排便相关或伴排便习惯改变的功能性肠病[1]。根据排便习惯改变的主要表现将IBS分为IBS腹泻型(IBS-D)、IBS便秘型(IBS-C)、IBS混合型(IBS-M)和IBS不定型(IBS-U)。我国以IBS-D最多见，一项多中心的调查研究显示符合罗马Ⅲ标准的IBS-D患者约占66.3%[2]。IBS-D的病因复杂，发病机制尚未完全阐明，大量的研究表明早期不良生活事件和精神疾病与IBS的发病具有密切的关系[3-4]。母子分离和束缚应激作为2种不同的精神心理因素早已被用于建立IBS动物模型研究[5-6]，这2种方法均可导致实验大鼠内脏敏感性增高，排便异常。目前尚无公认的IBS-D动物模型，有研究采用病原体灌胃和化学物质灌肠法造模模拟IBS-D[7-8]，也有研究基于内脏高敏感动物模型叠加致泻因素造模[9]。本研究拟采用精神心理应激叠加致泻因素建立IBS-D大鼠模型，并比较分析不同精神心理应激造模方法的特征和差异。

1材料与方法

1.1 材料

1.1 动物 SPF级SD孕鼠8只，孕期(18±2)d，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号：SCXK(京)2012-0001，选用新生雄性大鼠造模，全部饲养于中国中医科学院西苑医院SPF级实验动物中心(室温22～25 ℃，相对湿度45% ～60%，光照周期12 h/12 h，自由进食、饮水)。

1.1.2 药物 番泻叶水煎剂(0.45 g生药/mL)，由中国中医科学院西苑医院制剂室统一制作。

1.1.3 试剂与仪器 5-HT ELISA试剂盒，购至Abnova公司(货号：KA1894)；肥大细胞试剂盒，购至厦门迈威生物科技有限公司(货号：MT-022)；5-HT即用型抗体，购至北京中杉金桥生物技术有限公司(货号：ZA-0231)；通用型二步法免疫组化检测试剂盒，购至北京中杉金桥生物技术有限公司(货号：PV-6000)。参照文献[10]自制直肠测压计，参照文献[11]自制T型大鼠束缚架和木质旷场箱(长和宽各100 cm、高40 cm，每列每行各画5个方格，中央9个为中央格，外周16个格称外周格)。Multiskan MK3酶标仪由Thermo公司生产。BX51光学显微镜和BX41图像采集系统均由日本Olympus公司生产。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将新生期SD大鼠随机分为非母子分离组和母子分离组，每组20只。母子分离组大鼠从出生后第2～14天，每天与母鼠分离3 h。非母子分离组不予分离。第9周，将非母子分离组随机分为正常组(N组)和慢性束缚组(R组)，将母子分离组随机分为单一母子分离组(S组)和联合应激组(SR组)，每组10只。参照文献[11]采用自制束缚架将R组和SR组大鼠每天制动束缚3 h，连续3周，其余2组不予束缚。在束缚期第3周，正常组给予生理盐水灌胃，其余各组给予番泻叶水煎剂(0.45 g/mL)灌胃(1 mL/100 g)，连续1周。

1.2.2 内脏敏感性的评价 参照文献[10]，将AWR评分=3时的压力数作为疼痛阈值，于束缚应激前后分别采用自制直肠测压计检测4组大鼠的疼痛阈值，评价其内脏敏感性。

1.2.3 大便评分 参照文献[12]制定大便评分标准：硬便1分，软便2分，不成形便3分，观察造模结束后4组大鼠每天6 h内的大便情况，连续观察5 d。

1.2.4 旷场行为学评价 在束缚应激前后采用自制木质旷场箱观察4组大鼠的行为学特征。实验在安静、四周无外界干扰并杜绝参照物的环境条件下进行，旷场箱上方安置摄像头，操作者轻轻将大鼠放入旷场箱的正中格内，开始同步录像，观察5 min内大鼠活动情况。观察总穿格数(三爪以上跨入同一格的次数)和站立次数(两前肢向上抬起离开箱底面或攀伏在侧壁上以后腿支撑使身体竖立的次数)。

1.2.5 检测指标与方法 采用水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，于4 ℃ 2 500 r/min离心15 min，取上清液分装至2 mL EP管中，-20 ℃冰箱保存备用，采用ELISA法检测4组大鼠血清中5-HT含量。处死大鼠后，截取距盲肠3 cm处的结肠组织，放入10%的中性甲醛溶液中固定，采用石蜡包埋切片，采用苏木精伊红(HE)染色观察4组结肠组织中的常规病理特征，采用甲苯胺蓝改良染色法观察肥大细胞(MC)数目，采用5-HT免疫组化法观察嗜铬细胞(EC)数目，每组10个样本，每个样本切片随机选3个视野观察。

2结果

2.1 内脏敏感性 在束缚应激前，与非母子分离应激组(N组、R组)比较，母子分离组(S组、SR组)痛觉阈值显著降低(P<0.05)。在束缚应激后，与N组比较，S组、SR2组痛觉阈值均显著降低(P<0.05)；R组痛觉阈值有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。SR组痛觉阈值均显著低于R组、S组(P<0.05)。见表1。

2.2 大便积分 造模期间，经母子分离应激大鼠成年后大便频次和性状无明显变化，短期束缚应激可使正常大鼠和母子分离大鼠的排便频次均明显增加，束缚一周后大便频次逐渐减少至正常，但大便含水量明显增加。经番泻叶灌胃可使4组大鼠出现急性腹泻，出现水样便或不成形便，但随着药物作用的消失，大便逐渐成形，含水量仍有增加。造模结束后，与N组比较，R组、S组、SR组3组大鼠大便积分均显著增高(P<0.05)。SR组大便积分显著高于R组、S组(P<0.05)。见表2。

2.3 旷场行为学 在束缚应激前，母子分离应激组(S组、SR组)的穿格数较非母子分离应激组(N组、R组)有减少趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；母子分离应激组(S组、SR组)的站立数明显低于非母子分离应激组(N、R组)(P<0.05)，SR组的站立数明显低于R组(P<0.05)，与S组差异无统计学意义(P>0.05)。在束缚应激结束后，与N组比较，R组、S组、SR3组的站立数及穿格数均显著降低(P<0.05)，SR组的穿格数明显低于S组(P<0.05)，与R组差异无统计学意义(P>0.05)。SR组的站立数与R组、S组差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4 血清5-HT水平 与N组比较，S组及SR组血清5-HT水平显著升高(P<0.05)，R组与之差异无统计学意义(P>0.05)。SR组与R组、S组比较，血清5-HT水平均显著升高(P<0.05)。见表4。

表1 4组大鼠束缚应激前后的痛觉阈值(mmHg，n=10)

注:与正常组比较，*P<0.05；与慢性束缚组比较，△P<0.05；与母子分离组比较，▲P<0.05

表2 4组大鼠造模后每天6 h内的大便积分(分，n=10)

注:与正常组比较，*P<0.05；与慢性束缚组比较，△P<0.05；与母子分离组比较，▲P<0.05

表3 4组大鼠束缚应激前后旷场行为学结果

注:与正常组比较，*P<0.05；与慢性束缚组比较，△P<0.05；与母子分离组比较，▲P<0.05

表4 4组大鼠血清5-HT水平

注:与正常组比较，*P<0.05；与慢性束缚组比较，△P<0.05；与母子分离组比较，▲P<0.05

图1 近端结肠组织病理(HE染色，×200)

注：N为正常组；R为慢性束缚组；S为母子分离组；SR为联合应激组

图2 近端结肠MC细胞甲苯胺蓝染色(×400)

注：N正常组；R慢性束缚组；S母子分离组；SR联合应激组

图3 近端结肠组织5-HT免疫组化染色(×200)

注：N为正常组；R为慢性束缚组；S为母子分离组；SR为联合应激组

2.5 近端结肠病理及MC、EC计数 结肠常规病理显示：N组结肠无异常，R组、S组、SR组3组结肠均有轻微充血，未见明显中性粒细胞浸润和间质水肿。见图1。甲苯胺蓝改良染色结果显示：光镜下MC胞质被染成紫红色，胞核呈蓝色，散布于黏膜固有层、黏膜下层。见图2。与N组比较，SR组大鼠近端结肠MC数目增多(P<0.05)，与S组比较，差异无显著性意义。免疫组化染色显示：EC分布于肠黏膜层，主要分布于肠腺腔内，细胞呈椭圆形、星状、楔形或不规则形，细胞质着色。见图3。与N组比较，R组、S组、SR组3组近端结肠EC数目显著增多(P<0.05)，SR组与R组、S组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 4组大鼠近端结肠肥大细胞、嗜铬细胞计数

注:与正常组比较，*P<0.05

3讨论

罗马Ⅳ标准规定IBS-D除具有腹痛症状外，超过25%的排便为Bristol粪便性状6型或7型，且少于25%的排便Bristol粪便性状1型或2型。其病理生理机制主要包括内脏敏感性增高、结肠动力增强、肠上皮通透性增加、脑-肠轴功能异常等等[13-14]。所以理想的IBS-D大鼠模型应具备上述病理生理特征。

本研究结果显示长期单一束缚应激(制动束缚，每天3 h，连续21 d)并不能提高实验大鼠的敏感性，与文献报道慢性不可预知应激(7种刺激因素，随机安排不重复，连续21 d)可导致成年大鼠内脏敏感性增高结果不同[15]，可能与长期单一束缚应激导致大鼠适应有关。早在1988年Williams等[5]采用限制部分活动的急性束缚应激诱发排便异常的大鼠模型模拟IBS，该方法可促进结肠运动，增加排便粒数，这种急性束缚应激同样可使实验大鼠内脏敏感性增高[16]。有研究比较了急性和慢性束缚应激的差异，结果显示连续4 d的慢性束缚应激也可提高大鼠的内脏敏感性，但低于急性束缚应激[17]。另有研究显示急性和慢性束缚应激对大鼠内脏敏感性的影响是暂时的，急性束缚应激短暂提高大鼠血浆促肾上腺皮质激素及皮质酮水平，而慢性束缚应激可长期提高这些激素水平[18]。

本研究结果显示母子分离应激可显著降低实验大鼠的痛觉阈值，说明母子分离应激可提高大鼠的内脏敏感性，与既往报道一致[6，19]。本研究发现间隔3周时间重复检测痛觉阈值，母子分离应激所致大鼠内脏高敏感性依然存在，说明母子分离应激所致内脏高敏感性大鼠模型持久稳定，重复性好。另有研究[10]报道新生期大鼠给予结直肠扩张或芥末油灌肠，成年后内脏敏感性增高，较成年期给予相同的应激所致内脏敏感性增高更明显。这与临床报道早期不良事件与IBS发病密切相关结果一致[3]。

本研究结果显示，新生期母子分离应激联合成年期慢性束缚应激组大鼠痛觉阈值显著降低，低于单一因素应激，说明精神心理因素联合应激可进一步提高实验大鼠的内脏敏感性，该方法尚无研究报道。

IBS-D腹泻具有慢性、反复发作的特点，本研究采用番泻叶灌胃可使大鼠出现急性腹泻，药效消失后则大便转实，尚不能模拟理想的IBS-D大便特征。本研究结果显示基于不同的精神心理应激因素，采用同样剂量的番泻叶灌胃也会使大鼠出现不同程度的腹泻，联合应激组大鼠经番泻叶灌胃后，腹泻时间延长、大便粒数增多，大便积分明显高于其他各组，考虑可能与其内脏高敏感性增高和结肠转运速度加快有关。

旷场实验是评价啮齿类实验动物运动功能和状态焦虑的经典方法，其中水平运动(穿格数)反映了动物的运动活性，垂直运动(站立数)反映了动物对新鲜环境的好奇程度[20]。本研究结果显示：慢性束缚组、母子分离组及联合应激组大鼠旷场穿格数和站立数均有不同程度的减少，说明精神心理应激导致实验大鼠运动活性降低，对新鲜事物的好奇程度也降低，符合焦虑抑郁样行为，与文献报道基本一致[21-22]。其中以慢性束缚应激对大鼠焦虑抑郁样行为影响最大。

从结肠病理来看，各组结肠均未出现炎性反应细胞浸润和间质水肿，符合功能性肠病的表现，说明基于精神心理应激联合番泻叶灌胃所致大鼠腹泻符合功能性肠病腹泻特征。

临床研究[23-26]显示5-HT与内脏敏感性具有密切的关系，IBS-D患者的血清和肠黏膜5-HT水平升高。本研究结果显示单一母子分离应激或母子分离联合束缚应激均可提高大鼠血清5-HT水平，与临床研究报道一致。5-HT作为自体活性物质，约90%合成和分布于肠嗜铬细胞。本研究结果显示，母子分离组及联合应激组大鼠近端结肠组织中EC数目高于正常组，与临床研究报道一致。

多个研究[27-30]表明IBS-D患者结肠组织中肥大细胞数目高于正常人，IBS内脏敏感性增高与肥大细胞脱颗粒具有密切的关系。本研究显示慢性束缚应激、母子分离应激具有使大鼠结肠肥大细胞增加的趋势，而两者联合可显著增加结肠肥大细胞数目，与上述临床报道一致。

综上所述，新生期母子分离应激可使大鼠出现持久稳定的内脏高敏感性和抑郁样行为；慢性束缚应激对大鼠内脏敏感性无明显影响，但可使大鼠出现明显的抑郁样行为，两者联合具有协同效应。基于精神心理应激联合番泻叶灌胃可模拟IBS-D的部分病理生理特征，基于母子分离+慢性束缚联合应激法建立IBS-D大鼠模型优于单一应激法。

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(2017-03-05收稿 责任编辑：杨觉雄)

ComparativeStudyofEstablishmentofaRatModelofIBS-DBasedonDifferentPsychologicalStress

Zhang Beihua1，Wang Wei2，Wang Fengyun1，Tang Xudong1

(1XiyuanHospitalofChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100091，China; 2BeijingHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,Beijing100039，China)

Objective:To explore a reliable rat model of IBS-D by comparing the differences of different psychological stress.Methods:A total of 40 neonatal rats were randomly divided into 2 groups:normal group and maternal separation group. The pups in the maternal separation group were exposed to 3 h period daily maternal separation from postnatal day 2～14, and then they were randomly divided into single maternal separation group(S) and combined stress group (SR) in the 9th week. The pups it the other group were left untreated and then were randomly divided into normal group (N) and chronic restraint stress group(R) in the 9th week. The group R and SR underwent chronic restraint stress by specially designed restraint frame 3 h daily for 3 weeks. The group N and S were left untreated. In the 12th week, the group N was given normal saline by gavage, the group R, S and SR were given Senna decoction (0.45 g/mL) by gavage(4.5 g/kg)for 7 days. The visceral sensitivity was tested and the animal behavior was evaluated by open field test before and after the chronic restraint stress. The fecal scores were calculated. The level of serum 5-HT, the number of mast cells (MC) and enterochromaffin cell (EC) of the proximal colon colon were tested after the modeling.Results:1) Visceral sensitivity:Before the restraint stress, the pain threshold of the maternal separation group(S、SR) were lower compared to the other group(N、R) (P<0.05). After the modeling, the pain threshold of the group S and SR were lower than group N (P<0.05), and there was no significant difference between the group R and N. 2) Fecal score:The fecal scores of group S, R, SR were significantly higher than the group N (P<0.05), the fecal score of group SR was significantly higher than the group S and R (P<0.05). 3) Open field test:Before the restraint stress, the horizontal motion of the group S and SR tend to decrease compared to the group N、R, while the vertical motion of the group S and SR were significantly lower compared to the group N、R(P<0.05). After the modeling, the horizontal and vertical motion of the group S and SR significantly decreased compared to group N (P<0.05). The horizontal motion of group SR was significantly decreased compared to the group S (P<0.05). 4) Serum 5-HT:The level of serum 5-HT increased in the group S and SR compared to the group N (P<0.05).There was no significant difference between the group R and N. And the level of serum 5-HT increased in the group SR compared to the group N (P<0.05). 5) Pathological features, the number of MC and EC in the proximal colon：There were no obvious abnormality in the Pathological features.The number of the MC in group SR increased significantly compared to the group N (P<0.05)，but there was no significant difference in the other groups. The number of EC in group R,S and SR increased significantly compared to group N (P<0.05).There were no significant difference among the group R, S and SR.Conclusion:The maternal separation stress, combined with chronic restraint stress and senna decoction by gavage could duplicate the IBS-D rat model, which is characterized with visceral hypersensitivity, abnormal defecation and depression.

Diarrhea-predominant rritable bowel syndrome; Modeling methods; Psychological stress; Comparative study

R282；R-332

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.035

国家自然科学基金资助项目(81403393，81173209，81373580)

张北华(1983.09—)，男，博士，主治医师，研究方向：中医药防治功能性胃肠病的基础与临床研究，E-mail：zhangbeihua888@163.com

唐旭东(1963.03—)，男，博士，博士研究生导师，主任医师，研究方向：中医药防治消化系统疾病研究，E-mail：txdly@sina.com