谭巧，莫美兰，陈现，胡晓东，黄春宇，陈文娜，曾勇

(深圳市中山泌尿外科医院生殖中心，深圳 518045)

35周岁以下女性囊胚冻融周期移植策略的探讨

谭巧，莫美兰，陈现，胡晓东，黄春宇，陈文娜，曾勇*

(深圳市中山泌尿外科医院生殖中心，深圳 518045)

目的探讨35周岁以下女性囊胚冻融周期移植策略，以期为保证单个移植周期妊娠率提供参考。方法选择2015年1月1日至2016年10月1日在本院生殖中心行冻融囊胚移植、年龄<35岁的患者，共1 539个移植周期。根据囊胚移植数目和囊胚等级分为4组：单优质囊胚移植组(单优组)、双优质囊胚移植组(双优组)、单非优质囊胚移植组(单非优组)、双非优质囊胚移植组(双非优组)。比较4组的临床妊娠率、种植率、早期流产率、继续妊娠率和双胎率。结果双优组的临床妊娠率(77.9%)、种植率(61.0%)、继续妊娠率(90.8%)显著高于单优组、单非优组、双非优组(P均<0.05)，早期流产率(8.3%)显著低于其它3组(P<0.05)，但双胎率(47.6%)亦显著高于其它3组(P<0.05)。单优组的临床妊娠率(51.6%)、继续妊娠率(80.1%)和早期流产率(18.5%)与双非优组(分别为49.6%、80.2%、18.9%)比较无显著差异(P>0.05)，但双胎率(2.7%)显著低于双非优组(27.0%)(P<0.05)。单非优组的双胎率(1.4%)与单优质组(2.7%)相似，均显著低于双优组、双非优组，但临床妊娠率(37.6%)亦显著低于其它3组(P<0.05)。结论35周岁以下女性囊胚冻融移植周期中，可优先选择移植1个优质冻融囊胚；当无优质冻融囊胚时，可选择移植2个非优质冻融囊胚以保证一定的单个移植周期妊娠率。

选择性单胚胎移植； 冻融胚胎移植； 双胎妊娠率； 临床妊娠率

(JReprodMed2017，26(9)：891-895)

体外受精-胚胎移植(IVF-ET)作为治疗不孕不育的一项重要技术，为越来越多的家庭带来了福音。然而，近年来，随着IVF的迅速发展及广泛应用，双胎妊娠率亦明显增加，是自然妊娠的几十倍[1]。据报道，欧洲2010年IVF妊娠中，双胎妊娠率为19.2%[2]。美国2013年IVF妊娠分娩中，双胎分娩占41.1%[3]。双胎妊娠由于妊娠期、分娩期并发症多，围产儿和新生儿死亡率高，给患者的家庭和社会造成严重的负担[4]。因此，如何降低IVF双胎率逐渐引起生殖领域专家们的重视。

目前降低双胎妊娠最有效的措施就是进行单胚胎移植(SET)[5]。近十年来，随着胚胎体外培养系统以及冷冻技术的不断完善[6]，选择性单胚胎移植(eSET)尤其是选择性单囊胚移植(eSBT)日益成为一种趋势。甚至在一些IVF费用属于医疗保险报销范畴的欧洲国家，eSET已成为一项法律规定[7]。而在中国，eSET的执行情况远不如欧洲国家，可能存在以下几个方面的原因：(1)eSET可能影响单次移植周期妊娠成功率。虽然有研究表明，SET可增加单次取卵周期的移植周期数，而获得多个胚胎移植相似的妊娠率[8]。但由于增加了时间以及经济成本，仍有很多生殖中心以及患者追求单次移植周期妊娠成功率。(2)不孕患者对双胎妊娠风险的认识不足。(3)当前尚缺乏eSET的标准。

本研究以行冻融囊胚移植的年轻患者(取卵年龄<35岁[9])为研究对象，根据囊胚移植数目以及囊胚等级进行分组，比较单优质囊胚移植、双优质囊胚移植、单非优质囊胚移植、双非优质囊胚移植的妊娠结局，探讨35周岁以下女性囊胚冻融周期移植策略，为保证一定的单个移植周期妊娠率提供参考。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2015年1月1日至2016年10月1日在本院生殖中心行冻融囊胚移植的1 423例年轻患者的病例资料，共1 539个移植周期。根据囊胚移植数目和囊胚等级，分为单优质囊胚移植组(单优组)、双优质囊胚移植组(双优组)、单非优质囊胚移植组(单非优组)、双非优质囊胚移植组(双非优组)4组。纳入标准：女方取卵年龄<35岁；第5天(D5)或D6冻融囊胚移植。排除标准：同一移植周期混合移植优质囊胚及非优质囊胚。

本研究获本院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

二、研究方法

1.囊胚培养：IVF或ICSI获得的胚胎，全部或剩余胚胎行囊胚培养，D5和D6分别观察囊胚形成情况。

2.囊胚分期及质量分级[10]：1期为囊胚腔<胚胎总体积的1/2；2期为囊胚腔体积大于或等于胚胎总体积的1/2。扩张期囊胚(3～5期)：3期为完全扩张囊胚，囊胚腔完全占据了胚胎的总体积；4期为扩张囊胚，囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大，透明带变薄；5期为正在孵出的囊胚，囊胚的一部分从透明带逸出；6期为孵出的囊胚，囊胚全部从透明带中孵出，脱离透明带。

囊胚质量分级[10]：(1)内细胞团(ICM)分级：A：细胞数目多，结合紧密；B：细胞数目较少，结合较松散；C：细胞数目极少，难以辨别明显的ICM结构。(2)滋养外层(TE)分级：A：细胞数目多，囊胚四周均有细胞分布；B：细胞数目较少，上皮细胞较松散；C：上皮细胞层由稀疏的细胞组成。

3.囊胚处理标准：冷冻标准[11-12]：按照本中心常规，≥3期的囊胚且囊胚ICM质量和TE评级至少一个为C以上的囊胚冻存。废弃标准：1期囊胚或2期囊胚或ICM质量和TE评级为CC者。评分≥3AA、3AB、3BA、3BB的囊胚为优质囊胚。

4.囊胚冷冻和冻融：本中心全部采用玻璃化冷冻方法进行囊胚冷冻及冻融，冷冻及冻融操作按日本加藤公司(KitazatoBiophama，Shizuoka，Japan)玻璃化冷冻、解冻试剂盒说明书进行。移植日当天行囊胚冻融，冻融囊胚行激光辅助孵化后放入Quinns’s Advantage®囊胚培养液中，置于37℃、5%CO2、5%O2培养箱中培养1～2 h，观察囊胚扩张情况。

5.子宫内膜准备及囊胚移植：自然周期(NC)和人工周期(HRT)准备内膜。(1)NC：根据阴道超声(TVS)监测，月经天数≥10 d，优势卵泡直径≥14 mm，子宫内膜达到7～8 mm以上，排卵后第5天行冻融囊胚移植；(2)HRT：月经第3天起口服戊酸雌二醇(补佳乐，拜尔，德国)4 mg/d×5 d，根据内膜情况调整用药剂量及天数。15 d后B超监测子宫内膜厚度7～8 mm以上时，肌肉注射黄体酮60 mg/d至移植日，第6天行冻融囊胚移植。B超引导下行囊胚移植。自移植次日改用黄体酮凝胶(雪诺酮，默克雪兰诺，瑞士)90 mg/d阴道上药行黄体支持，直至移植后11 d测血β-HCG。

6.结局判断及观察指标：临床妊娠：移植28 d后阴道B超观察到孕囊或流产物病理证实。临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植囊胚周期数×100%；种植率=B超下见孕囊数/移植囊胚数×100%；早期流产率=妊娠12周期流产的周期数/临床妊娠周期数×100%；继续妊娠率=妊娠维持至12周以上周期数/临床妊娠周期数×100%；双胎妊娠率=双胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，对计量资料进行t检验，对分类变量资料采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者一般情况比较

1 539个冻融囊胚移植周期，其中单优组283个周期、双优组838个周期、单非优组194个周期、双非优组224个周期。4组取卵年龄、移植年龄、移植日子宫内膜厚度比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组患者一般情况比较(-±s)

二、各组患者妊娠结局比较

分别对4组患者的临床妊娠率、种植率、早期流产率、继续妊娠率、双胎率进行两两比较。双优组的临床妊娠率、种植率、继续妊娠率均显著高于单优组、单非优组、双非优组(P均<0.05)，早期流产率则显著低于其它3组(P<0.05)，但双胎率亦显著高于其它3组(P<0.05)。单优组的临床妊娠率、继续妊娠率和早期流产率与双非优组比较无显著性差异(P>0.05)，但双胎率显著低于双非优组(P<0.05)。单非优组的双胎率与单优组相似，均显著低于双优组、双非优组(P<0.05)，但临床妊娠率亦显著低于其它3组(P<0.05)(表2)。

表2 各组患者妊娠结局比较(%)

注：与其他3组比较，*P<0.05；与双非优组比较，#P<0.05

讨 论

自1978年英国首例试管婴儿出生，IVF-ET及其衍生技术为越来越多的不孕不育夫妇带来了希望。为了提高临床妊娠率及活产率，传统的IVF通常选择2～3个胚胎移植。随着IVF技术的不断完善，胚胎体外培养环境的不断优化以及培养体系的完善，胚胎的种植率以及IVF-ET的临床妊娠率不断提高，双胎妊娠率明显增加并居高不下。而多胎妊娠严重威胁着母婴的健康，并且妊娠胎数与不良妊娠结局有着明显的相关性。多胎妊娠早产的风险是单胎妊娠的7倍，在32周之前分娩的风险是单胎妊娠的14倍[13]。早产的并发症使围产儿死亡风险较单胎增加，其中双胎妊娠增高4倍，三胎妊娠增高6倍[14]。多胎妊娠增加新生儿和婴儿近、远期的患病率，如胎儿早产、低体重儿、极低体重儿、脑瘫、学习障碍、语言发展缓慢、行为困难、慢性肺病、发育迟缓和死亡的风险增加。多胎妊娠母体的并发症较单胎妊娠增加7倍，包括妊娠剧吐、妊娠期糖尿病、高血压、贫血、出血、剖宫产、产后抑郁症[15]。既往有剖宫产或肌瘤剔除史的患者，多胎妊娠增加了子宫破裂的风险[4]。早在2002 年，欧洲人类生殖与胚胎学会年会上就已经明确提出：单胎分娩是辅助生殖技术(ART)的首选结局，多胎妊娠应当视为ART的一项并发症[16]。2003年10月我国《人类辅助生殖技术规范》(卫科教发[2003]176号)中也明确规定“对于多胎妊娠必须实施减胎术，避免双胎，严禁三胎和三胎以上的妊娠分娩”。目前这也成为全世界的一个共识[17]。

临床上降低多胎妊娠的有效方法有两种：①施行减胎术；②减少移植胚胎的数目。减胎术是一种被动的补救措施，而减少移植胚胎数目才是一种积极的预防手段。降低双胎妊娠的最佳手段是SET[5]。早在1999年，就有eSET的提议[18]。而后，这项提议在临床上逐渐实施，最初在欧洲[19]和加拿大[20]，近年来被越来越多的国家接受及推广。在一些国家，eSET被制定为一项法律规定[7]。然而，在大部分国家，例如中国、美国，是否全面实施eSET仍存在争议[21]。其中一个重要原因为担心eSET可能影响单次移植周期的妊娠结局。自1999年首次提出eSET能有效预防双胎以来，关于SET与双囊胚移植(DBT)妊娠结局比较的文章层出不穷。eSET是否在降低双胎率的同时能维持良好的单次移植周期妊娠结局仍无定论。部分研究认为，eSET能显著减少多胎妊娠的发生，但妊娠率、活产率并不会因此而降低[22-24]。而梁明明等[25]的研究发现，在冻融周期中，无论是≤35岁或>35岁，单囊胚移植(SBT)的临床妊娠率、活产率均低于DBT。在本研究中，取卵年龄<35岁的患者，冻融囊胚移植周期中，无论是优质囊胚还是非优质囊胚，SBT的双胎率显著低于DBT，但临床妊娠率也显著降低。当移植的为优质囊胚时，SBT的早期流产率较DBT增高，继续妊娠率较DBT降低。提示SET可能影响单次移植周期的临床妊娠结局。虽然有研究表明，SET可增加单次取卵周期的移植周期数，而获得与多个胚胎移植相似的妊娠率[8]。但由于增加了时间及经济成本，所以仍有很多生殖中心以及患者追求单周期妊娠成功率。

缺乏eSET标准可能是阻碍eSET实施的另一个原因。合理的移植策略，对在实现降低双胎妊娠的基础上保证一定的单次移植周期妊娠率至关重要。美国生殖医学会推荐，年龄<35岁的女性患者实施eSET；年龄35～40岁的女性患者，如果存在优质胚胎时，可考虑eSET。本研究发现，年龄<35岁的女性，移植2个优质冻融囊胚，虽然临床妊娠率和继续妊娠率分别可达到77.9%和90.8%，早期流产率可下降到8.3%，但双胎率达到47.6%。移植1个优质冻融囊胚，虽然临床妊娠率下降，但仍可达到50%以上，维持在一个可接受的水平；而双胎率下降到2.7%。而当仅移植1个非优质冻融囊胚时，虽然双胎率可降到1.4%，但临床妊娠率下降到一个过低的水平(37.6%)。移植2个非优质冻融囊胚，可获得与单优组相似的临床妊娠结局，多胎率27.0%，介于移植两个优质冻融囊胚和单个冻融囊胚之间。

综上所述，在年龄<35岁的女性冻融囊胚移植周期中，若存在优质囊胚，可优先选择移植单个优质冻融囊胚。若无优质冻融囊胚，为了保证一定的单次移植周期移植妊娠率，可考虑移植2个非优质冻融囊胚。

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[编辑：侯丽]

Thestrategyoffrozen-thawedblastocysttransferinwomenlessthan35yearsold

TAN Qiao，MO Mei-lan，CHEN Xian，HU Xiao-dong，HUANG Chun-yu，CHEN Wen-na，ZENG Yong*

FertilityCenter，ShenzhenZhongshanUrologyHospital，Shenzhen518045

Objective： To investigate the strategy of frozen-thawed blastocyst transfer in women less than 35 years old，in order to provide guideline for maintaining a certain pregnancy rate of single transfer cycle.

Methods： The young women less than 35 years old came to the reproductive center of Shenzhen Zhongshan Urology Hospital from Jan.1 2015 to Oct.1 2016 were enrolled in this study.The data of 1 539 frozen-thawed blastocyst transfer cycles were analyzed.The transfer cycles were divided into four groups according to the quantity and quality of blastocyst：single high-quality blastocyst group，double high-quality blastocysts group，single poor-quality blastocyst group，and double poor-quality blastocysts group.The clinical pregnancy rate，implantation rate，early miscarriage rate，ongoing pregnancy rate and twin pregnancy rate were compared among the four groups respectively.

Results： The clinical pregnancy rate (77.9%)，implantation rate (61.0%)，ongoing pregnancy rate (90.8%) in double high-quality group were significantly higher than those in single high-quality group，single poor-quality group and double poor-quality group (P<0.05).The early miscarriage rate (8.3%) was significantly lower than those in other three groups，while the twin pregnancy rate (47.6%) was significantly higher than those in other three groups (P<0.05).The clinical pregnancy rate (51.6% vs.49.6%)，ongoing pregnancy rate (80.1% vs.80.2%)，early miscarriage rate (18.5% vs.18.9%) in single high-quality group were not significantly different to those in double poor-quality group (P>0.05)，while the twin pregnancy rate was significantly lower than that in double poor-quality group (2.7% vs.27.0%，P<0.05).The twin pregnancy rate in single poor-quality group (1.4%) was similar to single high-quality group (2.7%)，but it was significantly lower than double high-quality group and double poor-quality group，while the pregnancy rate (37.6%) was yet significantly lower than that in other three groups (P<0.05).

Conclusions： Single high-quality frozen-thawed blastocyst can be preferred to transplant for women less than age 35 years.Two poor-quality frozen-thawed blastocysts may be chosen to transfer in order to improve the pregnancy rate of single transfer cycle，if there is no high-quality frozen-thawed blastocyst available.

Selected single-blastocyst transfer； Frozen-thawed cycles； Twin pregnancy rate； Clinical pregnancy rate

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.09.008

2017-05-09；

2017-06-15

深圳市科创委基础研究项目(JCYJ20160427113514229)

谭巧，女，湖南衡阳人，硕士，主治医师，生殖医学专业.(*

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