李含晰，徐丰，石雪晖，刘昆玉，钟晓红*，杨国顺

（湖南农业大学园艺园林学院/湖南省葡萄工程技术研究中心，长沙 410128）

不同前处理方式对水晶刺葡萄枝叶中白藜芦醇含量的影响

李含晰，徐丰，石雪晖，刘昆玉，钟晓红*，杨国顺

（湖南农业大学园艺园林学院/湖南省葡萄工程技术研究中心，长沙 410128）

本文以水晶刺葡萄叶片和新梢为试验材料，采用超声波辅助提取白藜芦醇，高效液相色谱（HPLC）法检测其含量，并分别对烘干温度、破碎度对其白藜芦醇含量的影响进行研究。结果表明，水晶刺葡萄样品前处理在50～100 ℃范围内最佳烘干温度为90 ℃，在30～100目范围内最佳粉碎度为40目，在此处理下，水晶刺葡萄叶片白藜芦醇含量达到6.22±0.34 μg/g，水晶刺葡萄新梢白藜芦醇含量达到11.23±0.29 μg/g。

高效液相色谱法；水晶刺葡萄；白藜芦醇；前处理

白藜芦醇（Resveratrol）是植物次生代谢产物，研究发现白藜芦醇存在顺反式异构体，自然界中多存在反式白藜芦醇[1]，比顺式白藜芦醇生物活性和药理作用高。研究表明，白藜芦醇具有降低血脂、降低粥动脉硬化、抗癌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等药理作用[2-4]。野生葡萄种质资源刺葡萄（Vitis davidii Foëx.）的叶、新梢、果皮、酒渣中都含有大量白藜芦醇[5-8]。在湖南省怀化市发现的水晶刺葡萄是刺葡萄的新类型[9]，该刺葡萄生物学性状与普通刺葡萄有较大的差异，普通刺葡萄的果实都为紫黑色，而水晶刺葡萄的果实为白色。目前刺葡萄的研究多集中于种质资源[10-12]、抗病性[13-14]、酿酒[15-16]等方面，功能成分方面也多集中于刺葡萄籽油和花色素的提取与利用[17-19]，而有关水晶刺葡萄白藜芦醇前处理以及检测方面的相关报道较少。本试验以水晶刺葡萄修剪后的叶片、新梢为试验材料，采用超声波辅助提取白藜芦醇，高效液相色谱检测其含量，再分别对前处理中烘干温度、粉碎度对白藜芦醇含量的影响进行研究，为水晶刺葡萄修剪后的废弃枝叶中白藜芦醇的开发以及利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及设备

供试材料：试验以水晶刺葡萄修剪后的叶片、新梢为材料，采摘于湖南农业大学葡萄教学科研基地，基地采用“V”型架，株行距1.0 m×2.5 m，南北行向，2012年高接，砧木为红地球，常规管理措施。

供试试剂：白藜芦醇标准品（Aladdin公司，分析标准品）；乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；超纯水。

试验设备：Agilent 1260 LC高效液相色谱系统工作站，DAD检测器；101型电热鼓风干燥箱；高速万能粉碎机；KQ5200DE型数控超声波清洗器；电子分析天平；30目、40目、60目、100目标准筛。

1.2 方法

1.2.1供试样品含水量测定

称取修剪后的水晶刺葡萄叶片、新梢各200 g，清洗掉灰尘，平铺在干燥铝盘中，厚度适中，放入烘箱中烘干至样品质硬而脆、质量不再改变。重复测定3次，取平均值，含水量计算公式如下：

式中：W1为新鲜样品质量（g）；W2为烘干样品质量（g）。

1.2.2白藜芦醇标准曲线绘制

称取5.000 mg白藜芦醇标准品于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇混匀，定容为200 μg/mL的白藜芦醇标准品溶液。将白藜芦醇标准品稀释成5、10、20、40、80 μg/mL溶液进样分析，以白藜芦醇浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，建立线性回归方程。

1.2.3供试样品前处理工艺

（1）烘干温度。分别称取同一批修剪后的水晶刺葡萄叶片和新梢，分别放置在50 ℃、70 ℃、90 ℃条件下烘干至叶片和新梢质硬而脆、质量不再改变，记录干燥时间，过40目标准筛备用，用超声波辅助法提取白藜芦醇。

（2）粉碎度。取90 ℃条件下烘干水晶刺葡萄叶片和新梢，粉碎处理，分别过30目、40目、60目、100目标准筛备用，采用超声波辅助提取法进行白藜芦醇的提取。

1.2.4水晶刺葡萄枝叶中白藜芦醇超声波提取

准确称取样品粉末1.00 g，置于50 mL离心管中，加25 mL甲醇，封口避光超声1 h，11000 r/min高速离心10 min，取上清液，定容至25 mL棕色容量瓶中。进样前经0.45 μm微孔滤膜过滤，即为待测样品溶液。

1.2.5水晶刺葡萄枝叶中白藜芦醇含量检测

参照杨星星[3]的HPLC检测方法测定白藜芦醇含量，并对检测方法进行一定修改。色谱条件：（1）色谱柱：Agilent ZORBA SB-C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；（2）流动相：水-乙腈，梯度洗脱程序：0～10 min，10%乙腈；10～20 min，20%乙腈；20～30 min，40%乙腈，30～35 min，85%乙腈；35～45 min，10%乙腈；（3）流速：0.8 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL，检测波长：306 nm。各样品重复处理6次，计算白藜芦醇含量的平均值，白藜芦醇含量计算公式如下：

式中：C为根据回归方程计算得到的白藜芦醇质量浓度（μg/mL）；V为提取溶液体积（mL）；W为所称取样品粉末质量（g）。

1.2.6数据统计与分析

试验获得数据运用Origin 8.0和SPSS 17.0版数据处理软件进行统计和分析，白藜芦醇含量的单位为：μg/g（以干重质量计）。

2 结果与分析

2.1 供试样品含水量测定

新鲜水晶刺葡萄叶片含水量平行测定3次，得含水量78.00%、80.67%、81.33%，取平均含水量为80.00%。

新鲜水晶刺葡萄新梢含水量平行测定3次，得含水量72.40%、71.60%、71.60%，取平均含水量为71.87%。

2.2 白藜芦醇标准曲线绘制

测定稀释标准品白藜醇浓度，得到白藜芦醇线性回归方程为Y=173.89X+14.313，方程的相关系数R2=0.9995，表明线性关系良好。信噪比（S/N）为3∶1时，得到白藜芦醇质量浓度最低检出限为0.03 μg/mL。

将5 μg/mL的白藜芦醇标准品溶液和水晶刺葡萄叶片、新梢供试样品溶液用0.45 μm微孔滤膜过滤后，依次进样，得到白藜芦醇标准品溶液、水晶刺葡萄叶片、新梢供试样品溶液（见图1、图2和图3）的色谱图，白藜芦醇标准品溶液的保留时间为20.801 min，供试样品溶液的保留时间20.840～20.945 min。

2.3 烘干温度对水晶刺葡萄枝叶中白藜芦醇含量的影响

由表1可知，随着烘干温度的升高，烘干时间不断缩短，白藜芦醇含量也不断提高。叶片在50～90 ℃温度范围内随着烘干温度升高，烘干时间缩短，白藜芦醇含量不断增加。当烘干温度为90 ℃时，烘干时间最少，为4.7 h，比50 ℃所用的时间节省了3.06倍，白藜芦醇含量达到最高，为6.22±0.34 μg/g，比50 ℃时的白藜芦醇含量提高了3.51倍；新梢在50～90 ℃范围内随着烘干温度升高，白藜芦醇含量快速提高，当烘干温度为90 ℃时，烘干时间最少，为8.7 h，比50℃时所用的时间节省了4.13倍，白藜芦醇含量达到最高，为11.23±0.29 μg/g，比50℃时的白藜芦醇含量提高了5.82倍。在50～90 ℃范围内，新梢的烘干时间始终比叶片所需的时间多，多了将近1倍，而新梢的白藜芦醇含量始终比叶片高，这说明新梢白藜芦醇含量比叶片含量相对较高。

2.4 粉碎度对水晶刺葡萄枝叶中白藜芦醇含量的影响

由表2可知，水晶刺葡萄供试品粉末粉碎度不同，白藜芦醇含量也不同。水晶刺葡萄叶片粉末从30目到40目时随着粉碎度增加，白藜芦醇含量也增加，当粉碎度为40目时，白藜芦醇含量达到最高，为6.22±0.34 μg/g，而破碎度超过40目后，白藜芦醇含量明显减少；水晶刺葡萄新梢粉末从30目到40目时随着粉碎度增加，白藜芦醇含量也增加，当粉碎度为40目时，白藜芦醇含量达到最高，为11.23±0.29 μg/g，而破碎度超过40目后，白藜芦醇含量有所减少。

综上所述，水晶刺葡萄样品前处理在50～100 ℃范围内最佳烘干温度为90 ℃，在30～100目范围内最佳粉碎度为40目。

图1 反式-白藜芦醇标准品色谱图

3 讨论与结论

在笔者前期试验中，发现在水晶刺葡萄鲜叶中检测不到白藜芦醇，但在不同温度烘干后，都有白藜芦醇被检测出，且不同烘干温度对白藜芦醇含量的影响较大，尤其是在90 ℃烘干温度下，水晶刺葡萄叶片白藜芦醇含量达到6.22±0.34 μg/g，新梢中含量达到11.23±0.29 μg/g，这可能是离体后的样品还具有生物活性，在受到非生物胁迫时（高温），白藜芦醇等次生代谢物合成加剧。谢红旗等[20]的研究表明，中药材的采后干燥过程，对于药材来说是一个水分胁迫的过程，在这一过程中会启动植物的抗旱应激机制而导致某些次生代谢产物的量上升，本研究结果与此结论一致。还有可能是烘干温度越高，烘干时间就越短，白藜芦醇的降解时间也缩短。

图2 水晶刺葡萄叶片中白藜芦醇色谱图

图3 水晶刺葡萄新梢中白藜芦醇色谱图

水晶刺葡萄叶片的样品粉碎度对白藜芦醇含量的影响较大，通过粉碎可以将在薄壁细胞组织内的白藜芦醇释放出来。粉碎度越大，样品粉末越细，在相同的样品质量与溶剂体积条件下，粉末进样量增加，即在一定范围内，随着破碎度的增加，增大了粉末与提取溶剂的接触面积，含量提高。但当样品过于粉碎，粉末目数增加到一定量时，固液分离的难度加大，过滤时滤渣中残留的滤液量增多，损失加大，使含量反而下降，且粉末过细，提取出的杂质也越多，不利于色谱检测分析。本研究与王漫等[21]的研究发现结果较为一致。

不同前处理方式对水晶刺葡萄枝叶白藜芦醇提取有较大影响。试验结果表明，水晶刺葡萄样品前处理在50～100 ℃范围内最佳烘干温度为90 ℃，在30～100目范围内最佳粉碎度为40目。在此处理下，刺葡萄叶片白藜芦醇含量达到6.22±0.34 μg/g，刺葡萄新梢白藜芦醇含量达到11.23±0.29 μg/g。

表1烘干温度对白藜芦醇含量的影响

表2 粉碎度对白藜芦醇含量的影响

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The influences of different pretreatment methods on the resveratrol contents of young sprouts and leaves in Vitis davidii Foëx Shuijing

LI Hanxi, XU Feng, SHI Xuehui, LIU Kunyu, ZHONG Xiaohong*, YANG Guoshun
(Horticulture and Landscape College of Hunan Agricultural University/Hunan Engineering Technology Research Center for Grape, Changsha 410128)

In this paper, ultrasonic-assisted method were used to extract resveratrol from leaves and yound sprouts of Vitis davidii Foëx Shuijing respectively, to determine the resveratrol content by HPLC method. The influences of different drying temperature and degree of aperture on the content of resveratrol and the content variation of resveratrol in leaves and young sprouts of Vitis davidii Foëx Shuijing were investigated. The results showed that the optimum drying temperature and degree of fragmentation were 90 ℃ and 40 meshes respectively, in which the content of resveratrol in leaves reached 6.22±0.34 μg/g, the content of resveratrol in young sprouts reached 11.03±0.29 μg/g.

HPLC; Vitis davidii Foëx Shuijing; resveratrol; pretreatment method

S663.1

：A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.04.006

2017-06-06

湖南省研究生科研创新项目（cx2013B291）

李含晰（1992-），女，硕士研究生，主要从事葡萄功能成分研究。E-mail: 2686863245@qq.com

*通讯作者：钟晓红，女，教授，E-mail: xh-zhong@163.com