祁文翰，楼康薇，罗红宇

（浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022）

高F值寡肽液中芳香族氨基酸的脱除工艺优化

祁文翰，楼康薇，罗红宇

（浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022）

为了脱除酶解鱿鱼碎肉制备的寡肽液中芳香族氨基酸以提高寡肽的F值，研究了活性炭串联静态吸附法的脱除效果。在对活性炭型号进行筛选的基础上，探讨了温度、pH、固液比、吸附时间对芳香族氨基酸吸附效果的影响，通过正交试验优化了吸附工艺。结果表明，325目粉末活性炭吸附效果最好，最佳吸附条件为温度25℃、pH为2、固液比1:25，第一次吸附时间180 min，第二次吸附时间30 min，吸附后寡肽液F值达到25.209。

F值；高F值寡肽；活性炭吸附

高F值寡肽是一个由2～9个氨基酸残基组成的混合小肽体系[1]。在该体系中，支链氨基酸（BCAA:Val,Ile,Leu）与芳香族氨基酸（AAA:Trp，Tyr，Phe）的含量比值即F值应大于20[2]。高F值寡肽因独特的氨基酸组成、生理调节功能且寡肽分子较游离氨基酸更易被人体吸收等诸多优点[2]，已逐渐成为食品与医药领域研究的热点。

制备高F值寡肽的关键是在降低酶解液中的芳香族氨基酸含量同时，保留酶解液中的支链氨基酸，增大支链氨基酸与芳香族氨基酸含量的比值。目前去除高F值寡肽液中芳香族氨基酸的方法有很多，如凝胶过滤法、膜分离法、渗透蒸发技术、离子交换法、高效液相色谱法[3]等，但这些方法工艺复杂，成本较高，且产量较小，不适合工业化生产。活性炭吸附法不仅价格低廉，且吸附工艺简单，可重复利用，更适合用于高F值寡肽的大规模生产。研究表明，活性炭吸附效率高，且对疏水性化合物具有极高的亲和性[4]，而芳香族氨基酸与支链氨基酸都为疏水性氨基酸但活性炭对芳香族氨基酸的吸附作用力还包括其具有的非极性苯环侧链与活性炭表面存在的非极性吸附，因而当两类氨基酸同时存在时，活性炭会优先吸附芳香族氨基酸。已有文献报道采用活性炭吸附脱除芳香族氨基酸，如华从伶[5]利用胰蛋白酶与风味蛋白酶双步酶解米糟蛋白制得米糟蛋白寡肽液，通过活性炭一步吸附脱芳后测得寡肽液F值为37.62；孔芳[6]以Alcalase酶与风味蛋白酶双步酶解牛乳酪蛋白制得的牛乳酪蛋白寡肽液为原料，通过活性炭一步静态吸附去除芳香族氨基酸，所得产品的F值达到21.06。有资料显示，米糟蛋白与牛乳酪蛋白中支链氨基酸含量分别占氨基酸总含量的23.79%与17.09%，芳香族氨基酸含量分别占氨基酸总含量的26.30%与9.37%，因两种原料中支链氨基酸含量本身很高，故通过活性碳对芳香族氨基酸的特异性吸附很容易实现高F值。而鱿鱼碎肉中支链氨基酸与芳香族氨基酸占总氨基酸含量分别为18.22%与3.81%，均较低，因而加大了活性炭吸附芳香族氨基酸的难度。已有研究表明，高F值寡肽具有辅助治疗肝脑疾病、醒酒、抗疲劳、改善手术后病人蛋白质营养状态等多种生理功能[7]，目前临床上大多使用的是通过氨基酸配制而成的高支（支链氨基酸）低芳（芳香族氨基酸）的口服液。利用鱿鱼加工副产物碎肉制备的高F值寡肽不仅具有特有的生理活性，而且还具有小肽的优点，如小肽有特定的转运吸收机制，可直接被机体吸收，也能直接被组织蛋白质合成利用，参与组织蛋白质的合成[8]，特别适合体虚、消化吸收功能差的人群。同时还可以提高鱿鱼资源的利用效率、减少环境污染。因此，本文对活性炭串联静态吸附去除寡肽液中芳香族氨基酸的工艺可行性进行探究，为活性炭吸附法提高寡肽F值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

秘鲁鱿鱼加工边角碎肉，由浙江海力生集团有限公司提供。胃蛋白酶（3 000 U/g）、风味蛋白酶（21 000 U/g）购自广西南宁庞博生物工程有限公司；氢氧化钠、盐酸（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；1号活性炭（200目）、2号活性炭（150目）、3号活性炭（325目）购自江苏森森炭业科技有限公司；4号活性炭（220目）、5号活性炭（50目）购自成都科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

α-1502型紫外分光光度计（上海谱元仪器有限公司）；FJ300-SH型均质器（上海标本模型厂)；日立CR21G型高速离心机(日本日立公司)；HHS型恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）；SHA-B型恒温水浴振荡器（金坛市岸头良友实验仪器厂）；日立 L-8900型氨基酸分析仪（日本日立公司）；PHB-4型便携式pH计（上海仪电分析仪器有限公司）；LGJ-10型真空冷冻干燥机（河南兄弟仪器设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

原料解冻→匀浆→双酶分步水解→高温灭酶→离心过滤→超滤→活性炭串联吸附→离心→OD值测定→氨基酸组成分析。

其中，超滤是采用截留分子量为2 500的超滤膜，获得MW≤2 500 Da的寡肽酶解液组分。

1.3.2 芳香族氨基酸脱除效果的评价

支链氨基酸在波长为220 nm时有最大特征吸收峰，芳香族氨基酸在波长为280 nm时有最大特征吸收峰[9]，因此可以通过紫外分光光度计测定酶解液在220 nm与280 nm下的吸光值，并以OD220/OD280作为脱芳效果的评价指标反映酶解液中支链氨基酸与芳香族氨基酸的浓度比。

1.3.3 活性炭型号筛选

鱿鱼碎肉蛋白酶解液，经真空抽滤后取上清液，调节上清液pH，按固液比为1:20分别加入5种不同型号的活性炭静态吸附2 h，之后于8 000 r/min离心10 min取上清液，并测定上清液（稀释200倍）在220 nm与280 nm下的吸光度比值（OD220/OD280），筛选出芳香族氨基酸去除率与支链氨基酸保留率最优的活性炭型号。其中支链氨基酸保留率及芳香族氨基酸去除率计算方法如下。

1.3.4 活性炭吸附芳香族氨基酸的单因素试验

选定活性炭型号后，分别改变温度、pH、固液比、吸附时间，考察四个因素的不同水平对活性炭静态吸附效果的影响。

1.3.5 静态吸附工艺优化

根据单因素试验结果，以pH、固液比、吸附时间作为影响活性炭静态吸附脱芳效果的因素，设计三因素三水平正交试验，以脱芳后蛋白酶解液OD220/OD280比值作为考察指标，对活性炭静态吸附脱芳的条件进行优化。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal array design

1.3.6 二次吸附脱芳实验

将第一次活性炭吸附后的寡肽液于8 000 r/min离心10 min，取上清液，调节上清液温度为25℃、pH为2、固液比为1:25，考察二次吸附时间分别为15、30、45、60、120、180 min时，再次脱芳效果。

1.3.7 寡肽液氨基酸组成分析与F值的测定

利用氨基酸自动分析仪对脱芳前后寡肽液的氨基酸组成进行测定。按下式计算寡肽液的F值：

式中，Val、Ile、Tyr、Phe、Leu分别代表缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的含量。

2 实验结果与讨论

2.1 活性炭型号筛选

活性炭静态吸附是为了最大程度脱除芳香族氨基酸的同时尽量保证支链氨基酸的损失率较小，以提高寡肽液的F值。因此本实验以OD220/OD280、支链氨基酸保留率与芳香族氨基酸去除率为评价指标，筛选出吸附效果最佳的活性炭型号。结果如图1。

研究表明，活性炭制作原料的差异、比表面积的大小均可以影响活性炭的吸附效果[10]。本实验使用的1、2、3、4号活性炭均为粉末活性炭，5号为颗粒活性炭，从图1可以看出，5号活性炭为颗粒型，比表面积较小，吸附容量小。2号活性炭吸附能力最差，且吸附后OD220/OD280过低，因而不予考虑。而其余三种粉末活性炭目数更高，比表面积更大，具有更好的吸附力。1号活性炭与3、4号活性炭相比，虽然支链氨基酸的保留率更高，但芳香族氨基酸的去除率和OD220/OD280都更低。3号活性炭在三项评价指标中均优于4号，这是因为3号活性炭比表面积最大，吸附容量高于其它型号活性炭，故吸附效果最好，因此本实验选用3号活性炭（325目）作为吸附剂。

图1 不同活性炭吸附效果比较Fig.1 Comparison of absorption result of different activated carbon

2.2 活性炭静态吸附单因素实验

2.2.1 温度对活性炭吸附效果的影响

在pH为3，固液比1:20，吸附时间为3 h条件下，分别考察了温度为 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃时活性炭静态吸附芳香族氨基酸的效果，结果如图2。

从图2可以看出，伴随温度的变化，芳香族氨基酸去除率、支链氨基酸保留率与OD220/OD280值均无显著性差异，由此说明在试验设计的温度范围内，温度对活性炭静态吸附效果影响不大。活性炭物理吸附的过程是一个放热过程，从热力学的角度分析，温度升高将导致活性炭吸附率下降[11]。本实验结果与热力学分析不一致，原因与活性炭对芳香族氨基酸的吸附机理有关。活性炭对氨基酸的吸附作用力主要包含静电作用力与非静电作用力，随着温度升高，堵在活性炭微孔口的分子和碳表面基团之间的静电作用力被削弱，因此芳香族氨基酸可以顺利通过微孔口，得以与自己的吸附位点接触，在这两种现象的共同作用下导致温度对活性炭吸附效果影响较低。因此，综合考虑OD220/OD280值和生产能耗因素，本试验选择常温25℃为最适温度。

2.2.2 pH对活性炭吸附效果的影响

在温度为25℃，固液比1:20，吸附时间为3 h条件下，分别考察了 pH 为 1、2、3、4、5、6 时活性炭静态吸附芳香族氨基酸的效果，结果如图3。

从图3可以看出，pH对活性炭静态吸附的效果影响显著，酸性条件下活性炭吸附能力最强，对芳香族与支链氨基酸都有较强吸附，原因可能与支链氨基酸与芳香族氨基酸的等电点有关，两类氨基酸的等电点均在5.48～6.02，因而当pH在低于这个范围的酸性条件下，易使含有该类型氨基酸的蛋白质带有正电荷进而增强了与活性炭之间的吸附效果[12]。因活性炭对芳香族氨基酸具有的非极性苯环侧链存在的非极性吸附作用力，因而活性炭对芳香族氨基酸的特异性选择吸附更强。脱芳反应的整体趋势为伴随pH升高，活性炭吸附能力降低，尤其对芳香族氨基酸吸附能力降低明显，OD220/OD280呈先增后降的趋势，在pH为2时达到最大，当pH为1时溶液酸性过强，蛋白质结构易遭到破坏，影响吸附效果。

2.2.3 不同固液比对活性炭吸附效果的影响

在pH为2、温度为25℃，吸附时间为3 h条件下，分别考察了固液比为 1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35时对活性炭静态吸附芳香族氨基酸的效果，结果如图4。

从图4可以看出，固液比对吸附效果的影响显著。溶液中支链氨基酸含量远大于芳香族氨基酸，所以当固液比较大时，活性炭对芳香族氨基酸的结合位点达到饱和，对支链氨基酸仍在吸附，造成支链氨基酸损失率增加，同时也增加了活性炭的用量，导致离心等后续操作的困难。而当固液比较小时，溶液中芳香族氨基酸含量超过活性炭吸附容量，导致芳香族氨基酸去除率过低，OD220/OD280的数值也过小，不利于蛋白酶解液的高F值化。而当固液比为1:25时，OD220/OD280数值达到最高，因此本实验确定固液比为1:25为最佳静态吸附条件。

图2 温度对吸附效果的影响Fig.2 The influence of temperature on absorption result

图3 pH对吸附效果的影响Fig.3 The influence pH on absorption result

图4 活性炭固液比对吸附效果的影响Fig.4 The influence of solid-liquid ratio of activated carbon on adsorption result

2．2．4 吸附时间对活性炭吸附效果的影响

在pH为2、温度为25℃，固液比为1:20条件下，分别考察了时间为 30、60、120、180、240、300 min 时活性炭静态吸附芳香族氨基酸的效果，结果如图5。

从图5可以看出，伴随吸附时间的增加，支链氨基酸的保留率逐渐降低但变化不大，芳香族氨基酸去除率逐渐升高后趋于稳定，OD220/OD280值在180 min达到最高。在30 min时支链氨基酸保留率最高而芳香族氨基酸去除率较低，但OD220/OD280比值已达到10．27，造成这一现象的主要原因为蛋白水解液中除支链氨基酸与芳香族氨基酸外还含有其他多种氨基酸，而多数氨基酸在220 nm的波长下都具有吸收，因而220 nm的吸光度只能粗略反应支链氨基酸的保留率，在280 nm具有特征吸收峰的氨基酸只有芳香族氨基酸[13]，因而在吸附过程刚开始时，会因多种氨基酸与活性炭吸附速度较快而导致220 nm下吸光度突降，随着吸附的进行，当吸附解吸达到平衡后，此时通过蛋白水解液在220 nm下的吸光度反映支链氨基酸会更加准确。因此综合各项指标，吸附时间为180 min时活性炭吸附效果最佳，且OD220/OD280达到最大值11．28。

2．3 活性炭静态吸附工艺优化结果

因温度对吸附效果影响不显著，故确定25℃作为最适温度，不再优化。在单因素实验基础上，通过三因素三水平正交试验对活性炭静态吸附芳香族氨基酸的工艺进行优化，结果见表2。

图5 吸附时间对吸附效果的影响Fig．5 The influence of reaction time on absorption result

表2 正交试验结果Tab．2 Results of orthogonal array design

表3 方差分析结果Tab．3 Results of variance analysis

由极差分析可知，三因素对活性炭静态吸附效果的影响强弱顺序为C＞A＞B。由方差分析可知，活性炭固液比与pH值对吸附效果影响显著（P＜0．05），吸附时间对本实验影响不显著（P＞0．05）。通过正交实验优化可得出本实验的最佳工艺为A1B2C2。即pH为2、吸附时间为180 min，活性炭固液比为1:25。在此实验条件下进行了三次平行试验，测得脱芳后蛋白水解液OD220/OD280值达到14．97±0．21，说明此优化工艺是稳定可行的。

经氨基酸组成分析测得脱芳后蛋白水解液F值为12．81，未达到高F值寡肽要求，因而对再次吸附条件进行探究，以提高酶解液的F值。

2．4 二次吸附脱芳结果

通过单因素实验及正交优化设计实验可以得出，温度对活性炭吸附效果影响不大，pH为2、固液比为1:25时活性炭吸附效果最佳，因此本实验仅通过比较时间因素对活性炭的二次静态吸附效果的影响，目的是将寡肽液的F值提高至20以上，以满足高F值寡肽的要求。试验结果见表4。

表4 吸附时间对二次吸附效果的影响Tab．4 The influence of reaction time on the second absorption result

由表4可知，随着时间的增加，芳香族氨基酸去除率先升高并于30 min后趋于稳定，支链氨基酸保留率先降低，与45 min后逐渐稳定，吸附时间为30 min时的OD220/OD280比15min时显著升高并达到最大值，之后OD220/OD280呈下降趋势。原因主要在于酶解液经第一次吸附脱芳后，芳香族氨基酸含量降低，因而只需较短时间就达到吸附平衡，随着时间延长反而造成支链氨基酸的损失，因此确定二次吸附时间为30 min，通过三次平行实验验证了在此条件下，二次吸附酶解液OD220/OD280达到28．81±0．11，蛋白水解液F值为25．209，满足高F值寡肽要求。

2．5 氨基酸组成分析与F值的测定

对鱿鱼碎肉蛋白水解液、该水解液通过活性炭静态吸附优化工艺进行脱芳处理后，取上清液冷冻干燥并进行氨基酸组成分析，结果见表5～7。

由表5、6可知，经过吸附，支链氨基酸含量占总氨基酸含量的17．30%，芳香族氨基酸含量占总氨基酸含量的1．35%，且本实验的支链氨基酸保留率达到83．35%，芳香族氨基酸的去除率达到69．14%。理论上在波长为280 nm的条件下仅有芳香族氨基酸具有特征吸收峰，因而实验中利用测定280 nm数值判断芳香族氨基酸含量的方法可以较准确的反映出芳香族氨基酸的去除率，而220 nm波长下虽支链氨基酸具有最大吸收峰但仍有多种氨基酸具有吸收，因此在吸附过程中于活性炭在吸附支链氨基酸的同时也吸附了其他多种氨基酸，会导致通过实验中利用测定220 nm下吸光值反映的支链氨基酸的保留率较低。通过氨基酸组成分析得到的芳香族氨基酸去除率与实验中通过吸光度计算的芳香族氨基酸去除率相差不大，而支链氨基酸保留率确较吸光度法高出较多，验证了这一理论。但最优条件下吸附获得的蛋白水解液F值虽有了大幅提升，但仍仅达到12．81，并未满足高F值寡肽液F值大于20的标准。究其原因主要为本实验原料为秘鲁鱿鱼碎肉，具有水分含量高，蛋白含量低的特点，且不同种类鱿鱼的氨基酸组成区别较大，因而酶解液中含有较多芳香族氨基酸，导致了仅通过一步吸附实现高F值，因此需要进行二次吸附，将经过一次吸附的酶解液F值进一步提高。

由表7可知，经过活性炭的二次吸附，支链氨基酸含量占总氨基酸含量的13．65%，芳香族氨基酸基本吸附完全，余下含量仅占总氨基酸含量的0．54%，且样品F值达到25．209，满足高F值寡肽F值大于20的要求，因此制备的酶解液符合高F值寡肽的要求。

表5 活性炭吸附前酶解液的氨基酸组成分析Tab.5 Result of amino acid analysis of supernatant before the adsorption

表6 活性炭一次吸附后酶解液的氨基酸组成分析Tab.6 Result of amino acid analysis of supernatant after the first time adsorption

表7 活性炭二次吸附后酶解液的氨基酸组成分析Tab.7 Result of amino acid analysis of supernatant after the second time adsorption

3 结论

通过对活性炭静态串联吸附脱芳工艺优化，确定了第一次活性炭常温静态吸附的最佳工艺为：pH为2、吸附时间180 min，活性炭固液比1:25，此条件下制备的寡肽液OD220/OD280数值达到14.97±0.21，F值为12.81。第二次常温静态吸附的最佳条件为：pH为2、吸附时间30 min，活性炭固液比1:25，测得二次吸附寡肽液OD220/OD280数值达到28.81±0.11，F值为25.209，满足高F值寡肽F值≥20的要求，且芳香族氨基酸含量仅占总氨基酸含量的0.54%，为进一步的分离纯化提供依据。

致谢：舟山中学2015级中美AP班的张在洖同学与本文的部分试验及数据分析作图工作，在此表示感谢。

[1]FISHER J E,ROSEN HM,EBEIDAM,et al.The effect of normalization of plasma amino acids on hepatic encephalopathy in man[J].Suvgery,1976;80(1):77-91.

[2]TERUO M,YASUSHI M,MASAAKI K,et al.Amino acid ratios in plasma and tissues in a rat model of liver cirrhosis before and after exercise[J].Hepatolohy Research,2003,27(3):230-238.

[3]MOURE F,HOYO P D,RENDUELES M,et al.Demineralization by ion exchange of slaughterhouse porcine blood plasma[J].Journal of Food Process Engineering,2009,31:517-532.

[4]谷文英.肝性脑病防治肽-高F值低聚肽的研究[J].中国食品添加剂,2000,16(2):69-73.

[5]华从伶.米糟蛋白的提取及制备高F值寡肽的研究[D].南京:南京财经大学,2010.

[6]孔 芳.酶法水解牛乳酪蛋白制备高F值寡肽混合物[D].上海:上海海洋大学,2010.

[7]王喜波,迟玉洁.活性炭色谱法分离芳香族氨基酸制备高F值蛋清寡肽混合物的研究[J].食品工业科技,2005,26(6):55-57.

[8]刘金伟.酶法制备玉米高F值寡肽及其抗疲劳活性的研究[D].济南:山东轻工业学院,2012.

[9]万 菡.蛋清高F值寡肽的制备技术研究[D].武汉:武汉工业学院,2011.

[10]王 梅,谷文英,沈蓓英.活性炭色谱法分离制备高F值寡肽混合物[J].无锡轻工业大学学报,1998,17(4):41-45.

[11]TITUSA E,KALKAR A K,GAIKARB V G.Equilibrium studies of adsorption of amino acids on NaZSM-5 zeolite[J].Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,2003,223:55-61.

[12]王喜波,迟玉杰,孙 波.活性炭吸附分离芳香族氨基酸的研究[J].食品发酵与工业,2009,35(1):62-64.

[13]董 欣,王丽燕.氨基酸紫外光谱的再测定[J].德州学院学报,2015,31(2):44-46.

The Removal Process Optimization of Aromatic Amino Acids in High Fischer Ratio Oligo-peptide

QI Wen-han,LOU Kang-wei,LUO Hong-yu
(Food and Medicine School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

In order to remove the aromatic amino acid in the oligopeptide prepared by enzymatic hydrolysis to improve the F value of the oligo-peptide,the removal effect of the activated carbon series static adsorption method was studied.Based on the screening of activated carbon model,the effects of temperature,pH,solid-liquid ratio and adsorption time on the adsorption of aromatic amino acids were discussed,The adsorption process was optimized by orthogonal test.The results showed that the best adsorption conditions were as follows:temperature 25℃,pH 2,solid-liquid ratio 1:25,first adsorption time 180 min,second adsorption time 30 min,after adsorption the oligo-peptide liquid F value reached 25.209.

F value;high fischer ratio oligo-peptide;activated carbon adsorption

S986.2

A

1008－830X(2017)02－0122－08

2017-02-01

国家海洋局海洋公益性行业科研专项（201305013）

祁文翰（1993-），男，江苏溧阳人，硕士研究生，研究方向：水产品精深加工.

罗红宇（1968-），女，教授，研究方向：水产品精深加工.E-mail:lisa8919@163.com