毛木耳多糖对乙醇性肝损伤的保护作用

2017-09-16赵爽荣成博张淑曼刘宇陈杰

江苏农业科学 2017年12期

赵爽+荣成博+张淑曼+刘宇+陈杰

摘要：采用乙醇诱导正常人肝细胞L02形成乙醇性肝损伤的体外模型，通过检测细胞内甘油三酯（TG）、活性氧（ROS）含量、胞外谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性等指标，评价毛木耳多糖提取物对乙醇性肝损伤的的保护作用及机理。结果表明，毛木耳多糖提取物的最佳作用浓度为40 μg/mL时，与模型组相比较，细胞的存活率提高了26.84百分点，细胞内甘油三酯的含量显著下降，胞外转氨酶ALT和AST的活性降低。这一结果说明毛木耳多糖提取物能够提高损伤细胞的存活率，降低乙醇引发的肝内脂肪堆积，减少细胞凋亡，同时游离活性氧的检测结果显示毛木耳多糖提取物能够显著降低细胞内活性氧的含量，从而可推断其可能是通过抗氧化途径发挥防护作用。

关键词：毛木耳；多糖；乙醇性肝损伤；活性氧；胞外转氨酶

中图分类号： R284.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）12-0142-03

乙醇进入体内后主要是通过肝脏来完成代谢的，如果摄入的乙醇量过大，细胞色素P450 2E1（CYP2E1）会被诱导表达参与乙醇的代谢，产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS能够与生物大分子反应造成蛋白变性、酶失活、DNA结构改变、脂质过氧化，从而造成细胞的损伤[1]。大量摄入乙醇不仅引发肝损伤，还会促使乙醇性脂肪肝的形成，并向乙醇性肝炎、乙醇性肝纤维化、肝硬化转变[2]。据2006年公布的我国首部《中国居民营养与健康之行为和生活方式调查报告》中显示，我国居民现在饮酒率为21%，这一数字还在不断上升[3]，乙醇已成为继病毒性肝炎之后导致肝损害的第二大病因。

食用菌类多糖是一种非特异性免疫促进剂，能增强网状内皮系统的吞噬功能，提高调整机体免疫功能[4]；研究表明大多数食用菌多糖对各种病毒如流感病毒、单纯胞疹病毒等具有抑制作用[5]；研究发现多糖的多种生物活性均与抗氧化性有关，通过缓解疾病、辐射、代谢等引起的氧化应激达到治疗和预防肿瘤发生、免疫力低下等疾病[6]。多糖的抗氧化性可能是其多种活性的作用机理之一。毛木耳多糖具有抗氧化[7]、提高免疫[8]、降低血糖血脂[9]等功能，并且可以抑制化学致癌物及促癌物对肿瘤的诱发[10]，因此在保健食品方面具有广阔的应用前景。毛木耳多糖保护乙醇性肝脏损伤功能研究是一个全新的领域。本研究主要目的是在乙醇性肝损伤模型的基础上，探索毛木耳多糖提取物保護肝细胞乙醇性损伤的作用，为毛木耳多糖的开发以及深加工食品的研发奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器

细胞株L02，购自中国医学科学院肿瘤医院；毛木耳3号菌株，笔者所在实验室保藏菌株；胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培养液、胰酶和双抗（青霉素和链霉素），购自美国Invitrogen公司；MTT测试液，购自美国Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO），购自美国Amresco公司；台盼蓝染液和无水乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司；BCA蛋白质定量检测试剂盒，购自北京博迈德生物技术有限公司；甘油三酯（TG）酶法测定试剂盒、谷草转氨酶（AST）测试盒、谷丙转氨酶（ALT）测试盒和细胞活性氧（ROS）试剂盒，购自南京建成科技有限公司。

MSC-1.2生物安全柜，购自美国Thermo公司；Steti-cycle371 CO2培养箱，购自美国Thermo公司；R-215旋转蒸发仪，购自瑞士Buchi公司；HYC-360药品保存箱，购自中国海尔公司；SHZ-88A恒温水浴锅，购自北京精科华瑞仪器有限公司；5810R冷冻离心机，购自美国Eppendrof公司；IX-71倒置显微镜，购自日本Olympus公司；移液器，购自美国Drummond公司。

1.2试验方法

1.2.1毛木耳多糖提取物的制备将毛木耳子实体放入高速万能破碎机进行破碎制备成约100目的均一干粉。称取50 g干粉，按1 ∶60比例加入去离子水，静置3 h，利用水浴摇床控制温度和转速对混合溶液进行提取，条件控制为 90 ℃、水浴4 h，6 000 r/min离心30 min，取上清，将沉淀物以上述方法再提取1次，合并上清液，利用旋转蒸发技术浓缩，确定多糖溶液的体积，加入4倍体积的无水乙醇使多糖析出，静置过夜待固液分离。通过6 000 r/min离心30 min，获得固体多糖，放至60 ℃的烘箱中烘干直至质量恒定，研磨成粉末状待用。功能检测时将多糖粉末配制成500 μg/mL的母液，其中多糖浓度以硫酸-苯酚法测定[11]。

1.2.2乙醇性损伤模型的建立L02细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（含1%青霉素、链霉素混合液）置 37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，待细胞生长至80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞浓度以 8×103 个/孔的细胞量接种于96孔培养板中，置于37 ℃培养箱中培养至细胞贴壁后，更换培养液，使培养液中乙醇浓度达到1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.5%、3.0%，设置对照组，继续培养48 h。以MTT方法测定细胞的存活率，以未加入乙醇的空白组作为对照，设定其细胞存活率为100%。

1.2.3毛木耳多糖提取物对乙醇性肝损伤的保护作用

1.2.3.1毛木耳多糖提取物对L02细胞的毒性评价取对数生长期的L02细胞，以8×103个/孔接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后，分别加入含多糖的培养液，使终浓度达到0、50、100、200、500、1 000 μg/mL，继续培养24 h，测定细胞存活率，分析多糖对L02细胞的毒性作用，设定对照组的细胞存活率为100%。

1.2.3.2毛木耳多糖提取物保肝作用细胞以浓度为 8×103 个/孔的接种量置于96孔培养板中，待细胞贴壁后，设置对照组（不加乙醇）和损伤模型组（乙醇终浓度为3%），治疗组的细胞中加入终浓度为3%的乙醇和不同浓度的多糖提取物（10、20、30、40、50 μg/mL），37 ℃培养48 h后，测定细胞存活率，设定对照组的细胞存活率为100%。endprint

1.2.3.3肝细胞特征性指标检测细胞以3×105个/孔接种于6孔培养板中，选用多糖提取物终浓度为40 μg/mL和损伤模型37 ℃培养48 h后，分别收集培养液和细胞，利用胞外谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）试剂盒测定培养液中的酶活力，利用组织甘油三酯测定试剂盒测定TG含量，用BCA法测定蛋白含量，细胞中加入荧光探针，利用组织内活性氧（ROS）测定试剂盒测定ROS的含量。

1.2.4数据统计分析采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理，试验结果以“平均值±标准差（x±s）”表示，采用 One-way ANOVA检验，P<0.05表示具有显著性差异。

2结果与分析

2.1肝细胞乙醇性损伤模型

本研究采用正常肝脏细胞株L02为载体细胞，以不同浓度的乙醇作为诱导条件建立损伤模型，评价毛木耳多糖对乙醇性肝损伤的改善作用。以前期建立模型的条件为基础[12]，检测乙醇刺激对L02细胞存活率的影响。从表1可知，在单纯乙醇因素的刺激下，随着乙醇浓度增加，细胞存活率明显下降，从86.59%下降到50.77%，各处理组与对照组比较均达到显著性差异（P<0.05）。这一检测结果与之前的研究结果相近，具有良好的重复性，说明此诱导方法能够建立起稳定的乙醇性肝损伤模型。细胞存活率检测结果显示30%乙醇对细胞损伤较大，细胞存活率降低至 50.77%，满足模型的需求，设定其为模型损伤浓度。

2.2毛木耳多糖提取物细胞毒性检测

多糖以终浓度0～1 000 μg/mL直接处理细胞，通过MTT检测发现所有细胞处理组的细胞存活率均在90%以上，且与对照组未达到显著性差异（P≥0.05），说明毛木耳多糖对

2.3毛木耳多糖提取物的保肝功能

以3.0%乙醇浓度的损伤条件和毛木耳多糖共同处理细胞48 h后发现，不同浓度的多糖均对细胞具有保护作用，但是保护效果并未呈现出剂量的依赖性。图2显示的是各浓度多糖对肝细胞的保护作用，其中多糖终浓度为10、20、30、 40 μg/mL 的处理组与模型组比较都能够显著性提高细胞存活率。其中多糖终浓度为40 μg/mL时，细胞的存活率最高，为84.79%，与模型组比较提高了26.86百分点，设定其为最佳护肝剂量。

2.4多糖提取物对肝细胞特征指标的影响

本试验不仅研究了多糖对细胞存活率的影响，同时以TG、胞外AST和ALT的指标反映多糖对肝细胞功能的保护作用。胞内TG含量检测结果显示毛木耳多糖提取物具有降低肝细胞中TG的作用，与模型组比较能够降低76.51%，说明其可以减少乙醇引起的胞内脂肪堆积；胞外转氨酶的检测结果发现多糖可以明显减少ALT和AST的胞外释放，保护肝细胞的结构完整性。ROS检测结果显示多糖提取物能够降低胞内活性氧的含量，说明毛木耳多糖具有抗氧化的作用，可以减小细胞因氧化而发生的损伤，推断其是通过抗氧化途径来发挥护肝功效的。

3结论与讨论

乙醇在肝细胞内主要是由乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶催化代谢的，摄入肝内后在脱氢酶和乙醇氧化酶系统作用下被氧化成乙醛，再氧化成乙酸，最后进入三羧酸循环被彻底氧化成CO2和H2O，并释放出能量[13]。此过程使辅酶不断转变为还原型辅酶，二者比例的改变抑制线粒体内三羧酸循环，脂肪氧化减弱，肝内脂肪酸合成增多[14]，最终导致肝脏中脂肪含量升高，因此TG是评价肝损伤的特征指标。从表2可知，48 h后提取物处理组的TG含量较模型组明显降低，说明毛木耳多糖能够有效缓解细胞中的脂质沉积作用。

ROS是以氧原子为中心的自由基及其活性衍生物[15-16]，细胞内线粒体是ROS产生的最主要来源[17]。氧化应激与乙醇性肝损伤关系密切，当体内产生的ROS过多，无法被抗氧化物质完全清除时，会发生氧化应激，過量的ROS会与生物大分子反应，造成机体的损伤，甚至导致疾病。从表2可知，经提取物处理48 h后，ROS指标检测结果表明毛木耳多糖提取物有效改善了肝细胞内的氧化水平。

ALT、AST是反映肝细胞损害情况最常用的酶学检查指标。AST是一种线粒体酶，乙醇在代谢过程中产生的中间产物乙醛、自由基等，可导致氧应激和脂质过氧化反应，造成线粒体损伤，使大量存在于线粒体的AST进入周围的循环系统[1]，因此乙醇性肝损伤细胞的培养液中AST升高。ALT主要分布于胞浆，在肝细胞质中有传输氨基酸的作用，研究表明仅有1%的肝细胞坏死，就可以使ALT增高1倍，因此，ALT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标[18]。从表2可知，经提取物处理48 h后，ALT和AST的释放量降低，说明毛木耳多糖提取物能够保护细胞的完整性，具有保肝的作用。

本研究通过细胞毒性检测表明毛木耳多糖提取物对肝细胞不具有细胞毒性，其能够提高肝损伤细胞的存活率，具有保护乙醇性损伤的作用。在多糖作用浓度为40 μg/mL时，细胞存活率与模型组比较可提高26.86百分点，细胞内甘油三酯和ROS的含量分别降低了76.51%和50.15%，培养液中ALT、ASL含量分别降低了35.76%、57.61%。研究结果证明毛木耳多糖不仅对肝细胞具有保护作用，而且可以促进肝细胞行使功能，具有开发应用前景。

参考文献：

[1]Miranda-Mendez A，Lugo-Baruqui A，Armendariz-Borunda J. Molecular basis and current treatment for alcoholicliver disease[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health，2010，7：1872-1888.

[2]胡克章，黄正明. 脂肪肝的发病机制与防治[J]. 解放军药学学报，2008，24（5）：433-435.endprint

[3]李怡. 推拿预防大鼠乙醇性脂肪肝的实验研究[D]. 南京：南京中医药大学，2008：3-4.

[4]郝瑞芳，李荣春. 灵芝多糖的药理和保健作用及应用前景[J]. 食用菌学报，2004，11（4）：57-62.

[5]杜巍，李元瑞，袁静. 食药用菌多糖生物活性与结构的关系[J]. 中国食用菌，2001，21（2）：28-30.

[6]魏磊，郑朝辉，侯成林，等. 四种野生食用菌粗多糖的抗氧化活性[J]. 微生物学通报，2011，38（10）：1533-1539.

[7]周学君，俞发. 毛木耳多糖的抗氧化作用[J]. 中国医院药学杂志，2000，20（10）：610-611.

[8]吴春敏，陈琼华. 毛木耳多糖对机体细胞的保护作用[J]. 中國药科大学学报，1991，22（5）：305-307.

[9]吴春敏，陈琼华. 毛木耳多糖抗凝血和降血脂作用[J]. 中国药科大学学报，1991，22（3）：164-166.

[10]孙运风. 食用菌多糖的药理作用及应用前景[J]. 社区医学杂志，2006，4（1）：29-31.

[11]赵爽，刘宇，王守现，等. 不同品种姬松茸菌丝体蛋白质和水溶性多糖含量的研究[J]. 食品工业科技，2010，31（12）：121-122，126.

[12]张淑曼，徐丽红，荣成博，等. 毛木耳蛋白提取物保护乙醇性肝损伤功能研究[J]. 食品科技，2016，41（2）：233-236.

[13]叶彬，潘发愤. 乙醇性脂肪肝和肝硬化患者各种血清酶的检测及其临床评价[J]. 浙江临床医学，2006，8（12）：1252-1253.