杨 丹，徐元芬，张 驰，2*

(湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000； 2. 湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

正交试验优化板栗中硒蛋白的提取工艺

杨 丹1，徐元芬1，张 驰1，2*

(湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000； 2. 湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

本实验优选恩施市富硒板栗，采用磷酸盐缓冲液浸提法提取硒蛋白，正交试验法优化板栗硒蛋白的提取条件，采用考马斯亮蓝G-250试剂结合法测定蛋白含量，原子荧光法测定硒含量。结果表明，影响富硒板栗含硒蛋白提取率的主次因素为:pH值>料液比>提取时间>提取温度，富硒板栗中含硒蛋白提取的最佳工艺条件是:pH值 8.2，提取温度50℃，提取时间1 h，料液比1∶55。富硒板栗干粉中的总硒含量为2.79μg/g，富硒板栗蛋白粉中的硒含量为5.125μg/g。本研究旨在为恩施富硒板栗的精深加工和综合利用奠定了理论和技术基础。

板栗；硒蛋白；提取分离；抗氧化活性

20世纪50年代，伴随着各种现代合成技术的出现，尤其是硒作为哺乳动物(包括人类)的必需微量元素地位的确立，关于硒的有机化学得到蓬勃发展，硒的营养作用也成为人们研究的热点。已有文献报道，癌症、心血管疾病、克山病、白内障、肌肉萎缩症等40多种疾病的发病率与缺硒密切相关[1]。硒具有很强的抗氧化及抗衰老作用。在防癌抗癌、预防和治疗心血管疾病、克山病及大骨节病等方面的重要作用已为世人所公认[2]。硒还具有解除重金属中毒等特殊的生理功能[3-4]。全世界有四十多个国家和地区属于缺硒地区。中国是一个缺硒的大国，根据《中华人民共和国地方疾病与环境因素图集》揭示，从东北三省起，斜穿至云贵高原地区，存在一条低硒地带，占据中国国土面积高达72%的地区，而30%为严重缺硒地区[5-6]。

粮食作物等天然食物的硒含量较低[7]，目前人们正广泛应用微生物和动植物作为硒的生物有机化载体来进行富硒功能性食品研究开发，如富硒大米、富硒茶、富硒鸡蛋等[8-10]。这些都是使用简单的富集方法，生产出来的产品硒含量不高，产品技术含量低，满足不了人们对于富硒产品的需求。因此，利用高新技术对富硒食品进行深加工以及富硒食品的生产将会是今后的发展方向。板栗(学名:Castanea mollissimain )，是壳斗科栗属的植物，原产于中国，与枣桃杏李同为我国古代五大名果之一，也是世界上著名的干果树种，生长于海拔370～2800 m的地区，多见于山地，已由人工广泛栽培，国外称之为“健康食品”，是健胃补肾、延年益寿的上等果品[11-12]。板栗易贮藏保鲜，可以延长市场的供应时间。本研究以当前硒蛋白研究的现状为出发点，在查阅相关文献的基础上，结合前人的大量的研究经验，以恩施高硒区的板栗为研究对象，旨在通过单因素和正交试验，探讨板栗中硒蛋白的最佳提取工艺，在此基础上，对硒蛋白的生物活性，主要是对硒蛋白的抗氧化性做一定程度的研究。为恩施硒资源的开发利用提供理论支持和应用基础。

1 材料与方法

1.1 原料及仪器

富硒板栗来自恩施土家族苗族自治州沙地产的板栗，取板栗干粉为实验原料。

试验使用试剂见表1。

表1 试剂

试验使用仪器见表2。

表2 设备

1.2 方法与步骤

1.2.1 板栗粉的制备及硒含量测定

富硒板栗→60℃烘干→粉碎→80目过筛→板栗标准粉。

参照文献[13-14]采用微波消解、原子荧光光度计测定样品中硒含量，三组平行实验。

1.2.2 蛋白质含量测定方法

蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250试剂结合法[15]。722型分光光度计595nm处测定吸光度值，绘制标准曲线。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 pH值大小对硒蛋白提取得率的影响

精确称取样品0.20 g于4个50mL小烧杯中，按料液比1∶40向小烧杯中加入不同pH值大小的0.05 mol/L的PBS磷酸缓冲液，pH值分别为6.3、7.3、8.2、9.1，置于40℃水浴锅中，提取1 h，然后3000 r/min离心分离10min。取上清液加入两倍体积过饱和硫酸铵溶液盐析过夜,离心取沉淀(7000r/min，10min)溶于磷酸盐中定容至25 mL容量瓶中，采用考马斯亮蓝G-250试剂结合法测得吸光度值。各pH值条件下通过4次平行实验来考察pH值大小对板栗蛋白得率的影响。

1.2.3.2 提取温度对硒蛋白提取得率的影响

分别准确称取板栗样品0.20g于4个50 mL小烧杯中，按料液比1∶40向小烧杯中各加入0.05 mol/L的PBS磷酸盐缓冲液(pH值=8.2)8 mL，温度分别控制在40、50、70、90℃，置于电热恒温水浴锅中，提取1h，然后3000 r/min离心10min，取上清液加入两倍体积过饱和硫酸铵溶液盐析过夜,离心取沉淀(7000 r/min，10min)溶于磷酸盐中定容至25mL容量瓶中，采用考马斯亮蓝G-250试剂结合法测得吸光度值。各温度水平通过4次平行实验来考察温度对板栗蛋白得率的影响。

1.2.3.3 提取时间对硒蛋白提取得率的影响

分别准确称取板栗样品0.20 g于4个50 mL小烧杯中，按料液比1∶40向小烧杯中各加入0.05 mol/L的PBS磷酸盐缓冲液(pH值=8.2)8 mL，置于40℃水浴锅中，分别提取30、60、90、120min，然后3000 r/min离心分离10min。取上清液加入两倍体积过饱和硫酸铵溶液盐析过夜,离心取沉淀(7000r/min，10min)溶于磷酸盐中定容至25mL容量瓶中，采用考马斯亮蓝G-250试剂结合法测得吸光度值。各提取时间水平通过4次平行实验来考察温度对板栗蛋白得率的影响。

1.2.3.4 料液比对硒蛋白提取得率的影响

精确称取样品0.20 g于4个50 mL小烧杯中，分别按料液比1∶10、1∶25、1∶40、1∶55向小烧杯中加入0.05 mol/L的PBS磷酸缓冲液(pH值=8.2)，置于40 ℃水浴锅中，提取1 h，然后3000 r/min离心分离10min。取上清液加入两倍体积过饱和硫酸铵溶液盐析过夜,离心取沉淀(7000r/min，10min)溶于磷酸盐中定容至 25 mL容量瓶中，采用考马斯亮蓝G-250试剂结合法测得吸光度值。各料液比条件下通过4次平行实验来考察温度对板栗蛋白得率的影响。

1.2.4 正交实验

采用正交试验优化提取工艺条件，根据单因素试验结果，选择合适的提取温度、提取时间和料液比水平，进行四因素四水平的正交试验设计，每个因素水平组合试验重复4次，见表3。

表3 正交试验因素水平表

1.2.5 板栗中硒蛋白的制备

称取板栗粉10 g→最优条件提取，离心取上清液(3000r/min，10min)→加入两倍体积过饱和硫酸铵溶液盐析过夜→离心取沉淀(7000r/min，10min)→溶于磷酸盐中→室温下透析4天，除去小分子杂质→透析液→蛋白质沉淀→真空干燥→板栗含硒蛋白样品。

2 结果与分析

2.1 蛋白质标准曲线

图1 蛋白质标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 pH值大小对板栗蛋白质提取率的影响

图2 提取pH值对蛋白提取得率的影响

由图2可知，提取pH值在6.3～7.3范围内，板栗蛋白提取率持续增大，且增幅较大；pH值在7.3～8.2范围内，板栗蛋白提取率仍有所增加，但增幅减缓；pH值为8.2时，蛋白提取率达到最高。8.2～9.1变化较平稳。因此，实验中板栗蛋白最佳提取pH值为8.2。

2.2.2 提取温度对板栗蛋白质提取率的影响

图3 提取温度对蛋白提取率的影响

由图3可知，提取温度在40～50℃范围内，板栗蛋白提取率持续增大，且增幅较大，50℃时，蛋白提取率达到最高。温度在50～70℃范围内，板栗蛋白提取率急剧减小。温度为70℃以后，由于温度过高，蛋白质被破坏，板栗蛋白提取率一直下降。因此，实验中板栗蛋白最佳提取温度为50℃。

2.2.3 提取时间对板栗蛋白质提取率的影响

分别按30、60、90、120min处理板栗样品，最终得到板栗蛋白提取率结果如图4所示。

图4 提取时间对蛋白提取率的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，板栗蛋白的提取率逐渐升高再下降。60～90min的时间内板栗蛋白提取率增幅较大；当提取时间达到90min时，板栗蛋白提取率达到最大。90min以后，由于板栗蛋白提取率出现下降。因此，此实验中板栗蛋白的最佳提取时间为90min。

2.2.4 料液比对板栗蛋白质提取率的影响

分别按料液比1∶10、1∶25、1∶40、1∶55处理板栗样品时，得到板栗蛋白的提取率如图5所示。

图5 提取料液比对蛋白提取率的影响

由图5可知，料液比由1∶10增到1∶25时，板栗蛋白提取率增幅最大。当料液比达到1∶25时，蛋白提取率开始下降。因此，最佳提取料液比是1∶25。

2.3 正交试验结果

2.3.1 正交试验结果数据

见表4。

表4 富硒板栗中硒蛋白提取条件正交试验结果

2.3.2 正交试验结果分析

使用SPSS统计软件对正交实验的结果进行方差分析，并得出各因素的估算边际均值。设因变量为蛋白提取率，固定因子分别为A(提取pH值)、B(提取温度)、C(提取时)、D(料液比)，软件输出的分析结果如表5所示。

表5 方差分析

由表5可知，矫正模型的的显著水平为0.01，表明模型有极好的显著性。因素A 显著水平小于0.01，表明提取pH值对富硒板栗含硒蛋白提取率有极显著影响。因素B、C、D显著水平大于0.05，表明提取温度、时间、料液比对富硒板栗含硒蛋白提取率没有显著影响。把因变量设为板栗蛋白的提取率，得到各因素的估算边际均值结果如表6。

由表6可知，因素A(提取pH值)各水平的边际均值大小为：8.2>9.1>6.3>7.2，所以选取的最佳提取pH值为8.2。

表6 pH值大小的边际均值分析表

表7 温度的边际均值分析表

由表7可知，因素A(提取温度)各水平的边际均值大小为：50℃>70℃>90℃> 40℃，所以选取的最佳提取温度为50℃。

表8 时间的边际均值分析表

由表8可知，因素C提取时间各水平的边际均值大小为:60min>30min>120min> 90min，所以本试验选取的最佳提取时间为60min。

表9 料液比的边际均值分析表

由表9可知，因素D料液比的各个水平的均值比较结果为：1∶55>1∶40>1∶10> 1∶25，所以选取的最佳提取料液比为1∶55。

综上所述，富硒板栗硒蛋白提取的最佳工艺条件组合为 A3B2C2D4，即提取pH值8.2，提取温度50℃，提取时间60min，提取料液比1∶55。

2.4 样品硒含量结果

通过计算后得板栗粉硒含量为2.79μg/g，板栗中硒蛋白硒含量为5.125μg/g。

3 结论与讨论

根据本实验研究可知，影响富硒板栗硒蛋白提取率的主次因素为:pH值大小>料液比>提取时间>提取温度，富硒板栗中含硒蛋白提取的最佳工艺条件是:pH值8.2，提取温度50℃，提取时间1 h，料液比1∶55。本实验所采用的恩施地区富硒板栗的硒含量比较高，富硒板栗干粉中的总硒含量为2.79μg/g，富硒板栗蛋白粉中的硒含量为5.125μg/g，表明板栗的富硒能力还比较好。中国营养学会推荐，成年人硒的日摄入量为50～250μg，该板栗适合作为硒摄入不足的人群的补硒剂。根据推荐可每天摄入17.9～89.6g板栗干粉，或者9.8～48.8g板栗蛋白粉。作为世界硒都的恩施，板栗资源十分丰富，研究高硒区生产的板栗硒蛋白的含量及提取分离纯化方法，将对丰富板栗资源的开发利用开辟新的思路，以及可以作为开发形式更加丰富、经济效应更好硒源食品的基础。

[1] 吴永尧,彭振坤.硒的多重生物学功能与人和动物的健康[J].湖南农业大学学报,1997,23(3):294-300.

[2] 罗世炜,史丽英,吴永尧.植物硒研究进展[J].生物学教学,2008,33(1):2-3.

[3] Gupta U C,Gupta S C.Selenium in soil and crops,its defici encies in livestock and human implications for management[J].Commun Soil Sci Plant Anal,2000,31:1791-1807.

[4] Rayman M P.The importance of selenium tohuman health[J].Lancet,2000,356:233 -241.

[5] 于 振. 陕西汉阴富硒地区主要农作物硒富集能力及其农产品中硒赋存形态和分布规律研究[D].西安：陕西师范大学,2013.

[6] 高 婧. 中国典型高硒与硒缺乏区硒营养摄入规律研究[D].北京：中国科学技术大学,2010.

[7] 况 冲，郭晓玲，张永忠，等.富硒大豆蛋白的研制[J].食品工业科技,2008(6):192-194.

[8] 王庆华,黄 伟,李前勇,等. 中国富硒食品的生产现状及趋势[J]. 广东微量元素科学,2008(3):7-10.

[9] 温立香,郭雅玲. 富硒茶的研究进展[J]. 热带作物学报,2013(1):201-206.

[10] 张现伟,郑家奎,张 涛,等. 富硒水稻的研究意义与进展[J].杂交水稻,2009(2):5-9.

[11] 肖佩明,任延碌.集安市在退耕还林中发展板栗产业的必要性[J].中国园艺文摘,2010,26(8):66-67.

[12] 庞文渌.板栗食用价值与加工技术[J]. 中国食物与营养,2003(11):48-49.

[13] 张修景. 微波消解-气相色谱法测定罗汉参中硒的含量[J].食品与发酵工业,2014(1):198-201.

[14] 卢 丽,韦晓群,刘二龙,等. 微波消解-氢化物发生原子荧光光谱法测定婴儿配方乳粉中硒含量[J]. 食品科学,2014(20):208-212.

[15] 李 娟，张耀庭，曾 伟，等.应用考马斯亮蓝法测定蛋白含量[J].中国生物制品学杂志,2000,13(2):118-120.

(本文文献格式：杨 丹，徐元芬，张 驰.正交试验优化板栗中硒蛋白的提取工艺[J].山东化工,2017,46(7):10-14.)

Optimization of Extraction of Selenoprotein from Castanea Mollissimain by Orthogonal Test

YangDan1,XuYuanfen1,ZhangChi1,2*

(1．School of Biological Science and Technology，Hubei Minzu University, Enshi 445000，China; 2．Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province，Hubei Minzu University，Enshi 445000，China)

Enshi Selenium-enriched chestnut was used as materials to extract selenoprotein by phosphate buffer extraction method and to optimize the extraction process of selenoproteins by using the orthogonal experiment. Proteins and selenium content was measured by coomassie brilliant blue G-250 reagent and AFS (atomic fluorescence spectrometry) respectively.Results showed that the factors affecting extraction rate was as follows: pH> ratio of solid-liquid>extraction time>extraction temperature.The optimum extraction conditions of selenoprotein from chestnuts were pH 8.2,extraction temperature 50℃,extraction time 1 hour and the ratio of solid-liquid 1∶55.The selenium content in Selenium-rich chestnut powder and Selenium-rich chestnut protein powder was 2.79 μg/g and 5.125 μg/g respectively.The aim of this study was to lay a theoretical and technical foundation for the intensive processing and comprehensive utilization of Se-enriched chestnut.

Castanea mollissimai；selenoprotein；extraction method

2016-12-25

国家自然科学基金项目(21461009)；湖北省科技厅重点基金项目(2011CDA011)；湖北省大学科技创新项目(201610517019)；2016年湖北省食品科学与工程省级实习基地建设项目

杨 丹(1990—)，女，本科，研究方向为食品化学；通信作者：张 驰(1965—)，男，教授，主要从事植物生物化学及硒资源研究。

O657.31

A

1008-021X(2017)07-0010-05