刘华雷，吕 艳，王静静，赵云玲，郑东霞，戈胜强，罗瑶瑶，魏润宇，王志亮

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

我国新出现基因XII型新城疫病毒的分布及特性

刘华雷，吕 艳，王静静，赵云玲，郑东霞，戈胜强，罗瑶瑶，魏润宇，王志亮

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

2010—2012年在全国新城疫主动监测中分离并鉴定出6株基因XII型新城疫病毒。这是我国首次发现该基因型病毒。分离到的XII型新城疫病毒全部分布在我国南方地区，多为水禽分离株，仅有1株为鸡源分离株。脑内接种致病指数（ICPI）和分离株F蛋白裂解位点的氨基酸组成证实分离株均为新城疫强毒。进一步的遗传进化分析表明，这6株分离株属于基因XIIb亚型，与南美地区的XII型分离株基因型不同（XIIa亚型）。对于国内新出现的基因XIIb新城疫病毒的来源，仍需要更多的监测数据来证实。目前的监测数据表明，这种在我国新出现的XII型新城疫病毒具有在当地造成地方流行和进一步扩散的风险。

新城疫病毒；基因XII型；进化分析；风险监测

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）强毒株感染引起的一种急性、高度接触性禽类烈性传染病，其不仅对家禽造成严重损害，还会影响国际贸易。世界动物卫生组织（OIE）将ND列为必须报告的动物疫病。我国将其列为一类动物疫病，并在《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》中列为优先防治和重点防控的动物疫病之一[1]。NDV具有遗传学多样性，可分为Class I和Class II两类，每类又可进一步分为多种基因型或基因亚型。目前Class II至少包括18个基因型[2]。其中，不同基因型病毒具有一定的宿主特异性和地域分布特征[3]。监测表明，基因VI型和VII型是我国目前流行的主要优势基因型，其中基因VI型主要在鸽群中流行，而基因VII型则主要在鸡和水禽中流行。目前在东南亚、中亚等地区流行的NDV与在我国流行的病毒具有一定的差异性。因此，在ND防控中，既要做好国内已有病毒的监测和评估，也要防止外来型（Exotic）NDV的传入。

基因XII型NDV于2008年首次报道在秘鲁出现[4]。后来的研究表明，这种类型病毒早在2004年就开始在当地呈地方流行。此外，在哥伦比亚等地也有该类型病毒发生和流行的报道[5]。2010年我国首次从广东省活禽市场中监测到基因XII型NDV，随后在福建省也分离到这种类型病毒。对于其来源，目前还没有直接证据来证实，估计候鸟迁徙在病毒跨境传入中起了重要作用。应警惕这种新型NDV在国内的分布和流行，加大主动监测力度，分析其流行和扩散趋势，开展疫苗免疫效果评估，以便为实现中长期规划制定的阶段性防控目标提供决策依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

按照国家动物疫病监测与流行病学调查计划，在广东省、福建省的活禽市场、屠宰场和散养户等不同环节，分别采集不同禽类的泄殖腔和口腔棉拭子，开展基于风险的NDV主动监测。

1.2 病毒分离与鉴定

按照常规方法接种10日龄SPF鸡胚，采用血凝和血凝抑制试验进行鉴定。对分离到的NDV按照文献[6]的方法进行噬斑纯化，将纯化后的病毒置-80 ℃保存。

1.3 病毒致病指数测定

取新鲜繁殖的NDV尿囊液，用无菌生理盐水作10倍稀释；每个样品脑内接种1日龄SPF雏鸡10只，0.05 mL/只，每24 h观察1次，连续观察8 d。每天观察，给鸡打分，计算其脑内接种致病指数（ICPI）。

1.4 F蛋白基因的RT-PCR扩增和序列测定

采用High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取NDV分离株的RNA，利用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（TaKaRa）按照文献[4]对不同分离株完整的F基因进行扩增。其中RT-PCR反应条件为：42 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 90 s，进行30个循环；72 ℃ 5 min。将扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，对鉴定为NDV核酸阳性的样品，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.5 遗传进化分析

用Lasergene对测定的不同分离株序列进行拼接与校正，分析各分离株在F蛋白基因裂解位点的氨基酸组成。将各分离株F基因序列与GenBank中公布的NDV经典毒株序列进行比对，采用MEGA6.06（Molecular Evolutionary Genetics Analysis，Version 6.06）[7]进行F蛋白基因遗传进化分析；采用邻位相连法（Neighbor-joining）及Kimura-2-Parameter模式进行系统进化树分析，将Bootstrap值进行500次重复运算。

2 结果

2.1 病毒分布

2010—2012年从广东省、福建省的活禽市场共分离到6株NDV。其分布在4个活禽市场。宿主、地点和时间分布等信息详见表1。

表1 本研究中的6株基因XII型NDV信息

2.2 脑内接种致病指数测定

6株NDV分离株1日龄雏鸡脑内接种致病指数均在1.74～1.93之间（表1），表明6株NDV分离株均为强毒株。

2.3 F蛋白基因分析

序列测定表明，6株病毒分离株F基因编码区长度均为1 662 bp，共编码553个氨基酸。6株分离株在F蛋白裂解位点的氨基酸组成均具有典型的NDV强毒株分子特征（表1）。这与其致病指数测定结果一致。6株病毒分离株之间的F基因核苷酸同源性在99.5%～100%之间，氨基酸同源性在99.1%～100%之间，表明6株分离株具有较高的同源性，说明这些病毒可能具有共同的来源。

2.4 遗传进化分析

通过构建NDVF基因编码区全长的遗传进化树（图1），可将NDV可分为ClassI和Class II两类，其中Class II又可分为18种基因型。按照Diel等提出的分类系统，本研究中的6株分离株均属于基因XII型，是在我国首次出现的基因型。与其遗传演化关系较为接近的是近年来在秘鲁和哥伦比亚等南美地区流行的毒株，但分属于不同的基因亚型。

图1 基因XII型新城疫病毒国内分离株F基因遗传进化树

3 讨论

ND是严重危害我国养禽业的烈性传染病之一。近年来，随着ND疫苗质量的持续改善、生物安全水平的不断提高、饲养模式的转型升级等，ND在我国的发生次数逐年下降，场点阳性率和个体阳性率均呈下降趋势[1]。但ND免疫失败现象时有发生，在部分地区仍呈地方流行。分子流行病学分析显示，我国目前流行的病毒具有多样性，基因型分布具有明显的宿主特异性。比如，目前在鸽群中流行的主要为基因VI型，在鸡和水禽中流行的则主要为基因VII型。值得关注的是，在我国边境地区还存在一些新传入基因型。比如，在广东和福建等省新出现的基因XII型，在云南省、贵州省新出现的基因VIIh型。

按照《国家动物疫病监测与流行病学调查计划》，本中心在我国部分省份开展了基于风险的ND病原学主动监测，调查范围涉及活禽交易市场、屠宰场和散养户。其中，2010年首次从广东省的鹅群中监测到1株基因XII型NDV。这是我国首次发现基因XII型病毒。基因XII型NDV于2008年首次在南美的秘鲁中被分离到，随后也有在孔雀中以及在哥伦比亚等地流行的报道。进一步分析发现，我国分离到的基因XII型NDV与在秘鲁等南美地区流行的XII型具有一定的差异性，分属于两个基因亚型，即XIIb和XIIa亚型。对于国内这种基因XIIb的来源，仍需要更多的监测数据去研究。自2010年我国首次检出这种新型NDV后，2011—2013年在南方个别省份也有发现。虽然由于监测范围和抽样等方面的局限性，近两年没有检出该型病毒，但其流行风险仍然存在。

因此，在ND防控中，既要做好基因VI、VII等国内已有基因型的监测和防控，也要做好对新出现的XII型NDV的系统研究，评估诊断和检测方法的有效性，加大监测范围和力度，预测分析其流行扩散的风险和趋势，综合评估现有疫苗的免疫效果。鉴于目前这种新型NDV仍然局限在我国南方部分省份，主要存在于水禽尤其是鹅中。建议在这些地区进一步加强病原学监测，强化免疫尤其是对水禽的免疫，开展免疫效果评估，尽量避免水禽和陆禽的混合饲养，提高生物安全水平，防止病原进一步扩散和蔓延。

[1] 刘华雷，王志亮. 新城疫的流行历史与现状[J]. 中国动物检疫，2015，32（6）：1-4.

[2] SNOECK C J，ADEYANJU A T，OWOADE A A，et al. High genetic diversity of Newcastle disease virus in poultry in West and Central Africa：cocirculation of genotype XIV and newly defined genotypes XVII and XVIII[J]. Journal of clinical microbiology，2013，79（24）：7867-7874.

[3] DIMITROV K M，RAMEY A M，QIU X，et al. Temporal，geographic，and host distribution of avian paramyxovirus 1（Newcastle disease virus）[J]. Infection，genetics and evolution 2016，39（4）：22-34.

[4] DIEL D G，SUSTA L，CARDENAS G S，et al. Complete genome and clinicopathological characterization of a virulent Newcastle disease virus isolate from South America[J]. Journal of clinical microbiology，2012，50（2）：378-387.

[5] CHUMBE A，IZQUIERDO-LARA R，TATAJELAVANDA L，et al. Characterization and sequencing of a genotype XII newcastle disease virus isolated from a peacock（Pavocristatus）in Peru[J]. Genome announcements，2015，3（4）：e00792.

[6] 赵明，戈胜强，王静静，等. 新城疫病毒DF1细胞蚀斑纯化方法的建立[J]. 中国畜牧兽医，2014，41（6）：4.

[7] TAMURA K，STECHER G，PETERSON D，et al. MEGA6：Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular biology and evolution，2013，30（12）：2725-2729.

（责任编辑：朱迪国）

Distribution and Characterization of Emerged Genotype XII Newcastle Disease Viruses in China

Liu Hualei，Lü Yan，Wang Jingjing，Zhao Yunling，Zheng Dongxia，Ge Shengqiang，Luo Yaoyao，Wei Runyu，Wang Zhiliang
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Six genotype XII Newcastle disease viruses（NDVs）were isolated and identified from active risk-based surveillance during 2010—2012. It was the first report of the genotype XII NDVs in China. All viruses were isolated from southern part of China，most of isolates were originated from waterfowl，and only one strain was isolated from chicken. All viruses were proved to be virulent based on the value of ICPI and the cleavage site of F protein. All NDV isolates were clustered into subgenotype XIIb，whereas reference XII NDVs isolated from South America were placed into subgenotype XIIa. More surveillance need to be conducted in order to identify the origin and source of the emerging genotype XII in China. The current monitoring data indicated that the emerging genotype XII viruses not only had the potential to cause ND endemic in local area，but also had high risk to spread into other parts of China.

Newcastle disease virus；genotype XII；phylogenetic analysis；risk surveillance

S852.65

B

1005-944X（2017）09-0001-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.09.001

国家重点研发计划（2016YFD0500800）；公益性行业（农业）科研专项（201303033）

并列第一作者：刘华雷、吕 艳、王静静

王志亮