陆 骏林 芳

（1 江苏省无锡药品检验所，江苏 无锡 214000；2 无锡济民可信药业有限公司，江苏 无锡 214000）

香丹注射液溶血检查的实验方法探讨

陆 骏1林 芳2

（1 江苏省无锡药品检验所，江苏 无锡 214000；2 无锡济民可信药业有限公司，江苏 无锡 214000）

目的常规体外试管法与分光光度法在香丹注射液溶血检查中的应用比较。方法通过吸收波长，试验恒温时间及离心转速的研究，建立了分光光度法测定溶血率的方法，并与常规体外试管法进行了溶血试验的结果对比。结果常规体外试管法判断没有溶血或不明显的结果，分光光度法均可测定出具体数值，且结果在溶血趋势上具有一定的一致性。结论分光光度法更为方便，准确。适用于香丹注射液的溶血监测使用。

常规体外试管法；分光光度法；溶血率

分光光度法进行溶血率测定的较多用于医疗器械[1-2]及包材[3]，根据红细胞破裂释放出来的血红素在545 nm波长处有最大吸收，通过测定溶液的吸光度从而定量测定样品的溶血率。本文采用2种溶血性试验方法（常规体外试管法和改进的分光光度法）对不同厂家香丹注射液进行对比考察，得出一些有益的结果，为临床用药安全提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器：紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司，TU-1800spc）；HH-4数显恒温水浴锅（金坛市富华仪器 有限公司）；80-2型离心沉淀机（上海手术器械厂）。

1.2 材料：香丹注射液A（厂家1，批号14060611）；B（厂家2，批号20151001）；C（厂家3，批号 141014）；D（厂家4，批号1309104）；E（厂家4，批号1309233）。

1.3 动物：新西兰家兔[体质量2.0～3.0 kg，雌雄不限，由无锡市惠山江南实验动物厂提供，实验动物生产许可证号SCXK（苏）2015-0004，实验动物质量合格证号NO.201508591]。

2 试验方法与结果

2.1 2%红细胞混悬液的制备：选取健康家兔1只，注射器心脏取血约20 mL。将抽取的血液迅速转移至已放入少量玻璃珠的洁净烧杯中，轻轻不断摇动10 min。除去纤维蛋白原，吸取血液转移至刻度离心管中，以约10倍量生理盐水洗涤，充分摇匀离心沉淀，弃去上清液，重复上述步骤3次，直至离心后上清液透亮，取2 mL红细胞，生理盐水稀释至100 mL，即成。当天使用。

2.2 最大吸收波长的确定：取洁净试管一支，加入5.0 mL新鲜蒸馏水，再加入5.0 mL 2%兔红细胞混悬液，轻度振摇，充分混匀，试管置37 ℃水浴孵育2 h后，取出置离心机中离心5 min（2000 r/min），吸取上清液，波长测量用紫外分光光度计在200～600 nm区域进行扫描，结果显示样品在545 nm处有最大吸收。

2.3 最佳离心速度与时间的选取：取洁净试管9支，先在各管中加入0.9%氯化钠注射液5.0 mL，再分别加入2%兔红细胞混悬液5.0 mL。充分混匀，37 ℃水浴孵育30 min。转速离心选取1000、2000、3000 r/min三个段位，离心时间分别选取5、10、15 min，分别取其上清液于545 nm波长处测定吸光度。

实验表明，当转速＜2000 r/min时溶液浑浊，部分红细胞未达到完全沉降，当离心速度为3000 r/min时，离心时因速度加速，部分药物分子及附加剂与红细胞发生碰撞的力量加大，导致溶血概率上升[4]，转速离心以2000 r/min，5 min较为合适。

2.4 常规体外试管法检查：选取12支洁净试管，实验设计“4×3”（分为供试品组、阳性对照组、阴性对照组，样品底色组共4组。每组各3支试管）。Ⅰ组为供试品组，各加入2%红细胞混悬液5.0 mL，样品0.6 mL，0.9%氯化钠注射液4.4 mL；Ⅱ组为阳性对照组，各加入2%兔红细胞混悬液5.0 mL和新鲜蒸馏水5.0 mL；Ⅲ组为阴性对照组，各加入2%兔红细胞混悬液5.0 mL和0.9%氯化钠注射液5.0 mL；Ⅳ组：样品底色组[5]，0.9%氯化钠注射液9.4 mL+样品0.6 mL混匀。将加样后的12支试管迅速放置37 ℃水浴，孵育2 h，观察结果。

2.5 结果：供试品组—香丹注射液A：3支试管中，一支有血凝聚现象，振摇有血凝块，多次振摇血凝块消失。无溶血现象。其余厂家香丹注射液无溶血与凝聚现象发生。

2.6 分光光度法检查：分别取“常规体外试管法检查”项下孵育2 h的溶液12管，离心5 min（2000 r/min），上清液在545 nm波长处测定吸收值，每组测得3支管的吸收度取其均值。按公式“溶血率%=（AIAIII-AIV）/（AII-AIII）×100%”计算溶血率[6]。结果见表1。

3 讨 论

3.1 本实验通过最大吸收波长的选取，试验恒温时间的研究和最适离心转速的探索，采用香丹注射液体外溶血性试验分光光度法测定溶血率结果，与常规体外试管法进行对比。数据表明，常规体外试管法肉眼观察判断结果其准确性易受药品本身颜色等因素影响。不同实验人员比对，主观判断差异较大[7]。试验时离心的速度[8]及温度的控制在操作时应多加注意，离心时因速度加速，部分药物分子及附加剂与红细胞发生碰撞的力量加大，导致溶血概率上升。

表1 分光光度法检查结果

3.2 实验结果表明同一厂家的香丹注射液，不同批号所测得的溶血度也存在差异。这可能与该品种中含有的鞣质、蛋白质、叶绿素等杂质的去除有关。该制剂的pH值、渗透压等理化性质及附加剂等也是产生溶血的因素。

3.3 试验中还采用了临床常用浓度的供试液(静脉滴注：一次10～20 mL，5%葡萄糖250～500 mL）稀释后使用。此时药液由于被稀释13.5倍，颜色干扰小，可采用肉眼判断。

3.4 中药注射剂溶血反应的特点体现在形成机制复杂[9]，发生范围广泛。采用体内、外多个试验相结合综合评价法，可能是一个有效的途径。此外，因不同的中药注射剂颜色及深浅不同，若色泽对血红素的最大吸收有干扰[10]。因本品为有色液体，特设一底色组。在开展香丹注射液溶血性实验时，将红细胞悬液和药物一并置37 ℃水浴，孵育2 h，分别通过观察上清液溶液的颜色肉眼判断，分光光度法测定吸光度计算溶血率来定量。分光光度法更为方便，准确。且结果与常规体外试管法在溶血趋势上具有一定的一致性。

[1] 中国药典.2015年版.一部[S].2015:附录.

[2] GB/T14233.2-2005.医用输液、输血、注射器具检查方法.第二部分:生物试验方法[S].2005.

[3] 国家食品药品监督管理局.药包材检验方法标准汇编[S].2003.

[4] 侯少贞,李耿.葛根素注射液体外溶血的实验研究[J].中药新药与临床药理,2011,5(22):289-291.

[5] Xu F.Clinical use and the adverse reactions of sodium aescinate[J]. Dis Monitor Control,2011,5(2):123-124.

R-331 文献标识码：B 文章编号：1671-8194（2017）23-0025-02