杨丹 包燚 陈丽梅 崔秀明

[摘要]在转录组测序的基础上，采用逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）技术，从三七主根中分离到三七病程相关蛋白10 （pathogensis related protein 10，PR10）基因，命名为PnPR102，测序结果表明该序列长465 bp，编码154个氨基酸。氨基酸序列同源性及系统发育树分析发现，PnPR102与人参的PR102蛋白同源性最高，具有典型的病程相关蛋白Bet v I 保守结构域。构建了重组载体pET32a（+）PnPR102，在宿主菌Escherichia coli BL21中诱导表达融合蛋白，优化诱导条件，PnPR102融合蛋白在E coli BL21中以可溶性和包涵体蛋白2种形式大量表达。纯化上清中的重组蛋白，运用纸片法分析纯化重组蛋白的体外抑菌活性，其对三七根腐病病菌腐皮镰刀菌Fusarium solani和坏损柱孢菌Cylindrocarpon destructans具有一定的抑制作用，猜测该基因可能参与了三七抗根腐病的防御反应。

[关键词]三七； 根腐病； 病程相关蛋白； 原核表达

Molecular cloning， bacterial expression analysis and functional

characterization of pathogenesisrelated PR102 gene in Panax notoginseng

YANG Dan1， BAO Yi1， CHEN Limei1， CUI Xiuming1，2， LI Kunzhi1*

（1Faculty of Life Science and Technology， Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， China；

2 Key Laboratory of sustainable utilization of Panax notoginseng Resources of Yunnan Province， Kunming 650500， China）

[Abstract]Base on the transcriptome analysis and RTPCR techniques，a pathogenesisrelated protein 10 gene was isolated from Panax notoginseng root and named as PnPR102 Bioinformatics and phylogenetic trees analysis revealed that open reading frame （ORF） of PnPR102 was 465 bp in length，encoding 154 amino acids，containing one typical conserved domain of pathogenesis related protein Bet v I family， and showed high similarity with that from P ginseng The recombinant expressed plasmid pET32a（+）PnPR102 was expressed in Escherichia coli BL21 The expression conditions were optimized and it could be expressed well in soluble and inclusion body protein Purified PnPR102 recombinant protein from the supernatant of cells was used to analysis the pathogen resistance activity by paper method The purified recombinant protein could inhibit typical root rot disease pathogen （Fusarium solani and Cylindrocarpon destructans）growth evidently， we conjecture that PnPR102 may participated in defense response of P notoginseng resistance to root rot disease pathogen

[Key words]Panax notoginseng； root rot disease； pathogenesisrelated protein； prokaryotic expression

受到致病菌的侵染后，植物中的一系列基因响应而上调表达，其中的一些基因與防御反应相关，包括病程相关蛋白（PR）和抑菌基因，其通过增强其蛋白活性来提高抗病能力。PR蛋白被认为可被病原菌和非生物胁迫诱导[12]。根据PR蛋白的结构和功能，目前PR蛋白在单子叶植物和双子叶植物中被发现并已确认了17个家族[3]。PR10是种子植物中广泛分布的一种PR蛋白，它与树木花粉过敏原和食物过敏源十分相似，属于Bet v Ⅰlike 超家族[4]，这类基因编码的蛋白质相对分子质量在15～19 kDa，等电点偏酸性，无信号肽、属胞内蛋白（intracellular pathogenesisrelated proteins，IPR）。PR10除了与植物的生物及非生物胁迫密切相关，还在植物的生长发育，次级代谢等过程中起着重要作用[58]。证据表明，PR10直接参与植物的防卫反应，具有体外抗菌活性或核酶活性[6，9]。endprint

三七Panax notoginseng （Burk） FHChen为我国传统的名贵中药材，多年来，其规模化种植受到以根腐病、白粉病等病害的严重限制，其中，根腐病常年发病率为5%～20%，严重的达70%以上，甚至绝收，且生长年限越长病害越严重[1013]，目前根腐病的控制手段主要以抗菌性农药的大量施用为主，根腐病的无害化防治已经成为了三七栽培技术研究的熱点和难点问题。三七根腐病病原菌比较复杂，致病菌包括细菌中的假单胞杆菌（Pseudomonas sp，真菌中的坏损柱孢菌Cylindrocarpon destructans，C didynum、镰刀菌Fusarium solani，F solani f sp radicicola，F oxysporum Schlecht，F scirpi Lamb等，通常以坏损柱孢菌、镰刀菌或假单胞菌中某一类为主，数种病原菌复合侵染，加速根系腐烂[11，13]。

本研究通过克隆三七中的PR102基因的编码序列，并进行生物信息学分析。通过原核表达载体将三七PR102基因转入大肠杆菌，进行重组蛋白的大量表达和纯化，通过研究三七PR102重组活性蛋白对三七关键根腐病致病菌的抑菌效果，为通过基因工程手段提高三七抗病性研究奠定一定的基础。

1材料与方法

11样品二年生三七由云南省农业科学院药用植物研究所提供，经昆明理工大学崔秀明研究员鉴定。三七PR蛋白抑菌试验所用菌株腐皮镰刀菌F. solani和坏损柱孢菌C. destructans，测试真菌由云南大学张克勤教授赠送，并报道了以上致病菌的分离、鉴定、致病性测定等研究结果。

12总RNA的提取、检测及cDNA第一链合成三七总RNA提取采用TRIZOL法从三七叶片器官中提取总RNA，利用分光光度计和1%琼脂糖电泳检测所提取RNA的纯度和完整性。以RNA为模板，oligo（dT）18为反转录引物，按照TaKaRa 公司的Prime ScriptTM RT Reagent 试剂盒说明书操作。

13PnPR102基因克隆与分析转录组测序筛选出表达差异显著的病程相关蛋白PR102，从CDS文件中获得PR102的拼接序列，将此片段用MEGA软件和三七相近的物种人参的全长PR102序列进行分析，发现该片段具有3′端和5′端。设计特异引物PR10F（5′GGATCCatgggtgtccaaaagaccgaaac3′，GGATCC为BamHI酶切位点）和PR10R（5′GAATTCctaatttgctaggaggtaagcttcaacagc3′，GAATTC为EcoRI酶切位点），采用大连宝生物公司提供的高保真PCR反应酶扩增该基因的开放阅读框，回收DNA片段，连接pMD18T克隆载体，转化，进行检测，测序。将测序结果进行序列比对，最终确定并获得三七PR102基因的完整ORF。

通过wwwExPASyProtParamtoolhtm 在线分析该基因编码氨基酸大小及其等电点，同时利用InterProScan软件分析PnPR102蛋白的保守结构域，预测其可能的信号肽区域和跨膜区域，利用DNAMAN对三七及人参、胡萝卜、芹菜等植物中PR10基因编码蛋白的相似性及进化关系进行分析。

14原核表达载体的构建将测序检测正确的pMD18TPnPR102载体质粒用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切，回收PnPR102基因片段。将pET32a（+）质粒用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行双酶切，回收线性载体片段。将回收的PnPR102基因片段和回收后的线性质粒载体进行连接，构建pET32a（+）PnPR102原核表达载体。进行PCR检测，测序鉴定。

15重组蛋白的诱导表达和纯化通过热刺激法将测序正确的pET32a（+）PnPR102的重组载体转入大肠杆菌的感受态细胞BL21中。摸索蛋白诱导条件，设计条件：IPTG浓度05，10，15 mmol·L-1，诱导时间2，4，6，8 h和诱导温度37，28，20 ℃，进行诱导。诱导后收集菌体，进行细胞破碎，分别收集上清和沉淀，进行SDSPAGE分析。

根据康为试剂可溶性蛋白纯化试剂盒的说明书，对PnPR102的重组蛋白进行纯化，为优化蛋白纯化条件，设置了不同的洗脱液条件进行洗脱，最终将纯化后的蛋白进行SDSPAGE检测。

16重组蛋白的抑菌试验采用已确定的三七根腐病典型病菌腐皮镰刀菌F solani和人参锈腐病菌C destructans为测试菌，采用滤纸片法测定提取物对测试根腐病病原真菌的抑菌活性。用打孔器将定量滤纸打成圆形纸片，121 ℃高温灭菌20 min，烘干备用。在培养皿（直径90 mm）中制备好灭菌的固体PDA培养基，使用接种针挑取少量三七根腐病病原真菌菌丝接种到PDA培养基上，28 ℃培养箱中培养96 h，初步形成圆形菌丝体。取不同浓度的PnPR102纯化重组蛋白滴到灭菌纸片上，晾1 min，将纸片放到PDA培养基中的病原菌菌丝体上，用20 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液（pH 70）作为对照，每个测试菌3个重复。由于2种菌株的生长速率不同，对腐皮镰刀菌F solani采用直径为15 mm纸片，加入纯化PnPR102重组蛋白溶液量为50 mL，对人参锈腐病菌C destructans采用直径为4 mm纸片，加入纯化PnPR102重组蛋白溶液量为10 mL。将培养皿置于28 ℃培养箱中培养24 h，观察抑菌圈的大小，即对病原真菌的抑制作用。

2结果与分析

21PnPR102基因的克隆通过转录组测序获得三七PR102序列，进行序列比对分析，发现该片段具有3′端和5′端。设计特异引物，采用大连宝生物公司提供的高保真PCR反应酶扩该基因的ORF，得到480 bp左右大小的条带，与目的基因的大小相符。回收DNA片段，连接pMD18T克隆载体，转化，进行PCR检测，送测序。将测序结果取出载体序列后进行序列比对，最终确定三七PR102基因的开放阅读框并获得含酶切位点的cDNA片段。将该cDNA片段在GenBank中进行了登记，命名为PnPR102，注册号为KY129859。endprint

将PnPR102序列输入NCBI中的ORF（open reading frame finder）（wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml） 和DNAMAN软件分析序列，结果显示PnPR102全长465 bp，编码154个氨基酸（图1）。同时，用ExPASY（ProtParam）软件分析PnPR102编码的蛋白质相对分子质量为16 5828，理论pI 441，分子式 C743H1180N182O239S3。PnPR102的154个氨基酸中碱性氨基酸（R，H，K）13个，酸性氨基酸（D，E）22个，非极性氨基酸（A，V，L，I，F，W，M，P）有66个，非电离的极性氨基酸（G，S，T，C，Y，N，Q）有53个。其中，带负电荷的氨基酸包括D和E，共计22个，带正电荷的氨基酸包括R和K，共11个。

22PnPR102基因的生物信息学分析三七PnPR102序列经Blastn比对后，检测与之覆盖率相对较高的几种植物，并获得与三七PnPR102蛋白相似其他植物PR蛋白质序列。选择与三七PnPR102蛋白亲缘关系相对较近的人参、胡萝卜、香芹菜、山芹菜、马铃薯、丹参、猕猴桃等植物的PR蛋白进行氨基酸序列比对，同源性分别为97%，62%，61%，57%，52%，51%，50%。以上基因编码的氨基酸序列长度相似，在N端和C端有较高的保守性（图2，3）。

利用DNAMAN软件进行同源性分析，将三七PR102蛋白与人参、胡萝卜、香芹菜、山芹菜、马铃薯、丹参、猕猴桃、芝麻、葡萄的蛋白构建了系统发育树（图4）。三七PnPR102蛋白与人参PR102蛋白（登录号：ACY369431）聚为一类，表现较近的亲缘关系。

利用在线工具InterPro（http：//wwwebiacuk/interpro/search/sequencesearch）对PnPR102蛋白预测保守结构域（采用默认参数），在PnPR10蛋白中发现其含有1个保守结构域家族，Bet v I型过敏源（Bet v I type allergen，IPR024949），该家族中含有病程相关蛋白 Bet v I结构PATHOGENESIS_BETVI，PS00451），位于89～120位，以及7个Major pollen allergen Bet v I 乳胶蛋白过敏原结构（Major pollen allergen Bet V I，PR00634），分别位于3～23，26～36，5～59，66～85，85～98，109～125，143～153位；此外，还在PnPR10蛋白中发现START类结构域（STARTlike domain，IPR023393），Bet v I乳胶蛋白结构域（Bet v I/Major protein，IPR000916）；2个Betv I类似结构域（SSF55961，cd07816）；2个未命名的结构域（PTHR31213，PTHR31213：SF14）。Bet v I 型过敏原（Bet v I type allergen）的基因本体（GO）预测表明，该蛋白参与防御反应（GO：0006952）和生物應激反应（GO：0009607）的生物学过程。

23PnPR102原核表达载体构建、重组蛋白的表达与纯化重组表达质粒转入大肠杆菌BL21中，根据诱导体系的优化，得到最佳诱导条件为：IPTG的终浓度为1 mmol·L-1，诱导时间为8 h，最佳诱导温度条件为20 ℃。收集诱导蛋白进行SDSPAGE检测，结果发现在预测的蛋白相对分子质量35 kDa（载体上蛋白标签大小约为18 kDa，蛋白质相对分子质量为1705 kDa）左右得到1条非常明显的蛋白条带，而在对照菌株蛋白中没有发现这条带，表明这个蛋白在大肠杆菌的感受态BL21中得到了成功的表达，而且表达量较高。在对菌体进行超声波破碎后，其上清和沉淀的SDSPAGE的结果表明目的蛋白在上清和沉淀中均自由表达，在上清中的蛋白含量远大于沉淀中的蛋白含量，说明诱导表达的蛋白大部分以可溶性蛋白的形式表达。

根据试剂盒可溶性蛋白纯化试剂盒的说明书，对PnPR102重组蛋白进行纯化，当洗脱液含80%结合液及20%洗脱液时，纯化蛋白浓度最高，但纯度较低；而当洗脱液含40%结合液及60%洗脱液时，蛋白纯化纯度较高，但浓度不高（图5）。蛋白纯化实验效果较好，测定了纯化后蛋白液的浓度后，-80 ℃保存，进行下一步实验。

24纯化PnPR102重组蛋白抑菌试验采用三七根腐病典型病菌腐皮镰刀菌F solani和人参锈腐病菌C destructans为测试菌，纸片法测试纯化的PnPR102重组蛋白的抗真菌活性，2个菌株经纯化PnPR102重组蛋白处理24 h后，均可见清晰的抑菌环，而对照未出现抑菌圈（图6）。在腐皮镰刀菌F solani抑菌试验中，对于高浓度的PnPR102重组蛋白处理所形成的抑菌圈大小明显大于低浓度重组蛋白处理。在人参锈腐病菌C destructans抑菌试验中，低浓度的PnPR102重组蛋白处理抑菌圈不显著（数据未体现），在高浓度PnPR102重组蛋白处理下形成了明显的抑菌圈。表明PnPR102重组纯化蛋白对典型根腐病病菌腐皮镰刀菌F solani和人参锈腐病菌C destructans有一定的抑制作用。

3讨论

PR10是广泛存在于高等植物中的一类非常重要的病程相关蛋白，其不仅参与植物对生物和非生物胁迫的防御反应，对植物的生长发育也有一定的功能。三七是我国，尤其是云南省重要的药材主栽品种，价值较高，由于受到根腐病等常见病害的危害，长期依赖农药等化学药品的控制，在一定程度上降低了三七的品质。因此，积极挖掘和研究三七本身的抗病基因，可以为找出对病害抗性好品种提供研究参考。本研究通过克隆三七病程相关蛋白10基因（PR10），与已发现的三七PnPR101基因是不同的2个三七PR10基因[14]，因此命名为PnPR102，丰富了对三七PR10基因家族的研究。PnPR102基因包含一个典型的Bet v I型过敏源保守结构域，表明该蛋白参与防御反应（GO：0006952）和生物应激反应（GO：0009607）的生物学过程。PnPR102序列与已知的其他植物如人参、胡萝卜、香芹菜等的PR10序列具有一定的相似性，尤其与人参的PR102序列相似度达到98%。endprint

本研究的核心目的在于研究PnPR102蛋白的抗根腐病病菌的效果，通过重组DNA技术，使目的基因在pET原核表达载体系统中借助Ecoli宿主表达菌大量诱导了PnPR102蛋白的表达，通过优化表达条件，PnPR102蛋白可以在破碎细胞的上清和沉淀中有较为理想的表达量，为后续的研究提供了较好的条件。从细胞上清中纯化回收得到了PnPR102重组蛋白，抑菌试验表明PnPR102重组蛋白对典型根腐病病菌腐皮镰刀菌F solani和人参锈腐病菌C destructans有一定的抑制作用，这与其他物种中发现的PR10蛋白具有体外抗菌活性的结论是一致的[6，9]，猜测该基因可能参与了三七抗根腐病的防御反应。

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[责任编辑吕冬梅]endprint