耿少辉 , 陈宇坤, 包 宇, 陈伟姣, 张颖茜, 王 蕾

(1. 河南中医药大学 第一临床医学院, 河南 郑州 450008;2. 河南中医药大学 药学院, 河南 郑州 450008)

3种点样方法对血清蛋白醋酸纤维膜电泳结果影响的对比研究

耿少辉1, 陈宇坤1, 包 宇1, 陈伟姣1, 张颖茜1, 王 蕾2

(1. 河南中医药大学 第一临床医学院, 河南 郑州 450008;2. 河南中医药大学 药学院, 河南 郑州 450008)

研究用盖玻片、滤纸和盖玻片+擦镜纸3种血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳点样方法对电泳结果的影响,评价盖玻片与擦镜纸相结合的新型点样方法在教学实验中的应用效果,并分析3组的蛋白质相对含量有无差异。结果表明：在相同实验条件下,盖玻片+擦镜纸组的电泳结果优于其他2种,3组的蛋白质相对含量无明显差异；盖玻片与擦镜纸相结合的点样方法较单纯使用盖玻片或滤纸的点样方法点样成功率有很大提高,出现的不良结果较少,能有效解决学生在电泳实验操作中的点样问题,可在教学实验中推广。

血清蛋白； 醋酸纤维薄膜； 电泳图谱； 点样方法

血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验是生物化学实验中最常开设的基本实验之一[1-2]。电泳实验步骤繁多,诸多因素可直接影响电泳所得蛋白质条带结果的准确性和可重复性[3]。点样作为其中的一个关键步骤,点样的成功与否直接影响实验结果[4]。点样操作的失败,一方面是因为点样器的自身缺陷；另一方面同时也是主要方面是点样人员的熟练度不够[5]。故选用一种高效且简单易操作的点样方法十分必要。

经过长时间教学实践与经验总结,王蕾副教授发明了盖玻片与擦镜纸相结合的点样方法,教学实践效果较好。本文通过对比盖玻片、滤纸和盖玻片+擦镜纸3种点样方法对电泳结果的影响,评估3种点样方法在教学实践中的应用效果,以提供一种更加有效实用的醋酸纤维素薄膜电泳点样方法。

1 材料

1.1 实验器材

北京六一DYY-8C型电泳仪电源,DYCP-38C型卧式水平电泳槽,7200型分光光度计,醋酸纤维素薄膜(2 cm×8 cm),染液缸,漂洗缸,镊子,滤纸,盖玻片,擦镜纸和培养皿等。

1.2 实验试剂和材料

试剂:巴比妥缓冲液:pH8.6,本实验用离子强度为0.07;染色液:氨基黑10B 0.5 g,溶于50 mL甲醇中,再加入冰醋酸10 mL,蒸馏水40 mL,混匀;漂洗液:冰醋酸5 mL,95%乙醇45 mL,蒸馏水50 mL,混匀;洗脱液:0.4 mol/L NaOH溶液[6]。

实验材料:人血清。

2 方法

2.1 实验前准备

在实验课开始之前,将醋酸纤维素薄膜浸于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中30 min左右,使其充分浸透,湿度均匀无白点[7],以便于学生操作。

2.2 实验分组

随机选取600名学习过基本实验操作技能的中西医临床大二学生,学生以班级为单位平均分为3大组,分别采用盖玻片、滤纸、盖玻片+擦镜纸点样方法进行电泳操作。不告知学生3种同点样方法对实验结果的影响。

2.3 点样

将完全浸透后的醋酸纤维素薄膜用镊子轻轻取出,夹于滤纸中轻压,吸去多余的溶液。

盖玻片组:手持盖玻片一端,使其蘸样端与血清平面平行没入血清样品中,使血清均匀分布在盖玻片点样端后迅速取出，随后将点样端垂直印于薄膜上无光泽面一端2.0 cm处,动作迅速,力度适中[8]。

滤纸组:将滤纸剪成比醋酸纤维薄膜略窄的长条状,从中间进行对折,使用对折端,与液面平行伸入血清样品,蘸取适量血清,待滤纸折痕端没入液面时迅速取出；将滤纸蘸有样品的折痕端垂直印于薄膜上无光泽一端约2.0cm处,动作迅速,力度适中[8]。

盖玻片+擦镜纸组:将擦镜纸剪成长约10 cm宽为4 cm的长条状,将盖玻片放置于擦镜纸中间,使擦镜纸完全包裹盖玻片一端；将点样端与血清样品液面平行伸入蘸取样品,迅速取出；将点样端垂直印于薄膜无光泽面的一端2.0 cm处,动作要迅速,力度要适中[8]。

2.4 电泳

待血清渗入薄膜后,以点样的无光泽面向下,薄膜两端放于电泳槽支架的纱布盐桥上,点样端放于电泳槽的负极,薄膜紧贴纱布并绷直。电泳槽同时放置的膜片之间互相间隔一小段距离,盖上电泳槽的盖子,接通电源进行电泳。室温下调节电压至110～140 V,电流约0.4～0.6 mA/cm,通电时间夏季为40～50 min,冬季为60 min左右[9]。本实验在冬季,通电60 min。

2.5 染色及漂洗

关闭电源后立即将薄膜取出,放入染色液中浸染3～5 min；然后依次移入放有漂洗液的3个培养皿中漂洗数次,至蛋白质条带清晰,背景无色为止；将电泳条带放在滤纸上,吸去多余的溶液,自然风干。

2.6 数据记录及定量

记录3种点样方法电泳结果的成功次数与失败次数,以及出现不良结果的次数。对比3种点样方法所得电泳条带的宽度与颜色。分别取3组中效果较好的电泳条带各6条，将蛋白质条带与一条空白带分别剪开,装入6支试管中,各管中加入0.4 mol/L NaOH溶液4 mL,振摇数次,使颜料色泽浸出。30 min后,使用7200型分光光度计在650 nm波长下进行比色,测各组分蛋白百分含量。

2.7 统计学分析

采用SPSS17.0软件对所得数据进行统计学分析:3组电泳成功率与出现不良结果的次数采用卡方检验进行数据分析；3组血清蛋白相对含量比较时采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 实验成功率对比

以电泳所得蛋白质条带中5条蛋白质条带清晰可见、易于辨识、图谱整齐、无拖尾或过于紧密为依据作为成功的标准[10]。3种点样方法所对应成功率的具体结果见表1。由表1可以看出：滤纸组的实验成功率比盖玻片组高,P<0.01；盖玻片+擦镜纸组成功率为90.5%与滤纸组的72.0%相比,P<0.01,具有统计学意义。对比可得,3种点样方法中采用盖玻片+擦镜纸相结合的方式进行点样在提高实验成功率方面具有最好的效果。

表1 3种点样方法实验成功率对比

注：与盖玻片组相比,△：P<0.01；与“滤纸”组相比,▲：P<0.01

3.2 不良结果出现次数对比

记录所得的每组出现不良结果——拖尾、电泳图谱不整齐、蛋白条带分离不清的次数的结果见表2。表2表明：在出现拖尾与蛋白条带分离不清的不良结果的次数上,滤纸组与盖玻片组差异不明显,P>0.05,盖玻片+擦镜纸组出现次数较少,P<0.01；电泳图谱不整齐这一不良结果出现的次数上,滤纸组与盖玻片+擦镜纸组差异不明显,P>0.05,两组均比盖玻片组的次数明显减少,P<0.01。以上结果说明,使用滤纸进行点样与使用盖玻片点样相比可以减少电泳图谱不整齐这一不良结果的出现,但在拖尾和蛋白条带分离不清出现的次数上效果不明显。使用改进后的盖玻片+擦镜纸结合的方法进行点样与单独使用盖玻片相比可以有效减少拖尾、电泳图谱不整齐、蛋白条带分离不清3种不良结果的出现。3种点样方法中盖玻片+擦镜纸的点样方法在减少不良结果出现次数上效果最好。

表2 3种点样方法不良结果出现次数对比

注：与盖玻片组相比,△：P<0.01；与滤纸组相比,▲：P<0.01

3.3 电泳条带宽度与颜色深浅对比

3种点样方法均可获得5条清晰蛋白条带,但蛋白条带宽度与颜色深浅略有差异,3种点样方法所得的具有代表性的电泳条带见图1。由图1对比可知：盖玻片组蛋白条带最窄,颜色也最浅；滤纸组蛋白条带最宽,颜色也最深；盖玻片+擦镜纸组颜色与宽度介于两者之间。盖玻片+擦镜纸组各蛋白条带宽度均匀、颜色适中、易于辨识。

图1 电泳图谱

3.4 各组分蛋白质相对含量对比

3种点样方法都证明了血清中各组分蛋白的相对含量排序:清蛋白>γ球蛋白>β球蛋白>α2-球蛋白>α1-球蛋白,即清蛋白占总蛋白比例最大,α1-球蛋白总蛋白比例最小[11]。使用分光光度计测得的3种点样方法各组分蛋白质相对含量(每种方法测6次,每组的平均值)见表3。采用单因素方差分析,3种点样方法在分离各组分蛋白含量方面差异没有显著性。

表3 3种点样方法各组分蛋白质相对含量对比 %

4 讨论

电泳实验在实验教学与科研中应用广泛,点样是电泳实验的关键一步,点样的成功与否直接影响着电泳的结果[4],选择高效且简单实用的点样方法来提高学生的点样成功率是十分必要的。

采用盖玻片进行点样会因为盖玻片端面不整齐,容易导致蘸取的样品量在盖玻片端分布不均匀,从而出现拖尾、电泳图谱不整齐或蛋白条带分离不清等不良结果[12],点样成功率较低。选用滤纸进行点样,可以通过滤纸的吸水性来解决盖玻片点样不均的问题,故电泳图谱不整齐出现的次数较使用盖玻片点样有所减少；但因滤纸吸水性好[13-14],容易蘸取过多的样品量,拖尾与蛋白条带分离不清的问题得不到解决。选用盖玻片+擦镜纸相结合的方法进行点样,因为擦镜纸的吸水性较滤纸低,盖玻片又能起到支撑作用,故能有效解决点样不均匀、点样量不易控制的问题，因此能够减少不良结果的出现,显著提高点样成功率。

电泳条带中各蛋白组分的宽度与颜色深浅主要与蛋白质的含量有关[15]。所蘸取的样品量越多,条带整体颜色越深,各组分蛋白条带也越宽。选用滤纸进行点样,因其吸水性较好,会蘸取较多的样品量,故蛋白条带整体颜色最深,各组分蛋白条带最宽。盖玻片因其点样面不整齐,蘸取的样品量多少不均匀,导致整体点样量偏少,颜色偏浅。选用盖玻片+擦镜纸进行点样,因为擦镜纸吸取的样品量小于滤纸而大于盖玻片,故条带颜色与各组分宽度介于二者之间。

综上所述,在相同且适宜的实验条件下,选用盖玻片+擦镜纸相结合的点样方法与单纯使用盖玻片或滤纸的点样方法相比,具有成功率高、不良结果出现次数少、条带颜色清楚易辨识等优点,能有效改善电泳效果。此外该方法操作简单、易于重复,是一种十分适合学生的点样方法。又因其原料易于获得,成本低,能源耗费少,是一种较为理想的醋酸纤维薄膜电泳点样方法,可在生化实验教学或科学实验中推广。

致谢:本文承蒙河南中医药大学基础医学院裴兰英老师与第一临床医学院李江波同学在文章修改与数据分析方面提供的帮助,《中医学报》主编程延安老师在图表方面提供的帮助,药学院武慧敏老师在选题方面提出的宝贵意见,特此致谢！

References)

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[15] 郑晓珂.生物化学与分子生物学实验[M].北京:人民卫生出版社,2015.

Comparative study of effect of 3 spotting methods on results of serum protein acetate membrane electrophoresis

Geng Shaohui1, Chen Yukun1, Bao Yu1, Chen Weijiao1, Zhang Yingqian1, Wang Lei2

(1. First Clinical Medical College, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China;2. College of Pharmacy, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China)

The effect of the serum protein acetate membrane electrophoresis by the three spotting methods of the coverslip, filter paper and coverslip+lens cleaning paper on the electrophoresis results is studied. The application effect of the new spotting method with the combination of the coverslip and the lens cleaning paper is evaluated and the difference of relative protein content of the three groups is analyzed. The results show that under the same experimental conditions, the electrophoresis result of coverslip+lens cleaning paper group is better than that of the other 2 groups, and there is no significant difference in the protein relative content of the 3 groups. The spotting method with the combination of the coverslip with the lens cleaning paper is better than the spotting methods of the coverslip and the filter paper, which greatly improves the successful rate. It can effectively solve the students’ spotting problem in the operation of electrophoresis experiments, and can be popularized in the teaching experiment.

serum protein; acetate membrane; electrophoregram; spotting method

10.16791/j.cnki.sjg.2017.08.016

2017-02-24

河南省教育科学十二五规划课题(2014-JKGHC-0100)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201610471013)

耿少辉(1997—),男,河南安阳,本科生,专业方向为中西医临床E-mail：shaohuigeng2016@163.com

王蕾(1963—),女,河南许昌,本科,副教授,主要从事生物化学与分子生物学教学与研究.E-mail：wangl131@sina.com

R446.1

B

1002-4956(2017)08-0060-03