荆 绮，倪慧艳，王 娟，徐 虹，易承学*

正交试验优化冬凌草冷浸提取工艺

荆 绮1，倪慧艳2，王 娟1，徐 虹3，易承学3*

目的 探讨冷浸法提取冬凌草的最佳工艺条件。方法 采用高效液相色谱法(HPLC)测定冬凌草甲素的含量，考察不同浓度乙醇对冬凌草甲素提取率的影响。在此基础上，选取乙醇用量、冷浸时间、提取次数和药材规格4个因素进行正交设计优化。结果 乙醇用量、冷浸时间、提取次数和药材规格对冬凌草甲素的提取效果均有显著影响，最佳提取工艺：冬凌草粉碎成细粉，加入15倍量体积分数95%乙醇，冷浸提取2次，每次4 d。结论 此工艺条件简单易行，适用于冷浸法提取冬凌草。

冬凌草；冬凌草甲素；冷浸提取法；正交试验

0 引言

冬凌草为唇形科香茶菜属植物碎米桠Rabdosiarubescens(Hemsl.) Hara的干燥地上部分，多年生草本植物，资源丰富，具有清热解毒、消炎止痛、健胃活血及抗肿瘤之功效[1]。其所含二萜类成分-冬凌草甲素(Oridonin)具有很强的抗癌活性，对肺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞呈抑制作用[2-6]，还具有抗炎作用，对蛋清诱导的大鼠足跖肿胀有明显的抑制作用[7]。冬凌草的提取方法有乙醇回流法[8]、超声波提取法[9]、超临界CO2萃取法[10]和渗漉法[11]。冬凌草甲素对热敏感，长时间受热易遭破坏，因而更适合于冷法提取。相比其他方法，冷浸提取法不需要昂贵的仪器设备，工艺简单，易操作且成本低，特别适于大规模工业化操作。本实验在单因素实验基础上，采用正交试验设计，以高效液相色谱法测定提取物中冬凌草甲素的含量为指标，优选出冷浸法提取冬凌草的最佳条件，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪，包括G1311C 四元泵、G1315D 紫外检测器、G1316A 柱温箱、G1329B 自动进样器(美国安捷伦公司)；XP 205电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q Integral超纯水机(美国密理博公司)；R-210旋转蒸发仪(瑞士步琪公司)；DJ-10A粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司)。

冬凌草2015年购自安徽省方氏中药饮片有限公司(经江苏大学药学院童珊珊副教授鉴定为唇形科香茶菜属植物碎米桠的干燥地上部分)，冬凌草甲素对照品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度≥98.0%，批号：E1526003)，甲醇(色谱纯，德国默克化工)，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Zorbax Eclipse plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-水(体积比为60∶40)，流速：1.0 mL/min，检测波长：239 nm，柱温：30 ℃，进样体积：10 μL。在上述色谱条件下，冬凌草甲素的保留时间为6.78 min，典型色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 标准曲线绘制 取冬凌草甲素7.02 mg，精密称定，置容量瓶中用甲醇溶解后定容至刻度，制成1.404 mg/mL的标准品储备液。逐步用甲醇稀释成16.86、28.08、56.16、112.32、168.48、224.64 μg/mL的系列对照品溶液。按“2.1”项色谱条件，取上述对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定冬凌草甲素色谱峰的面积。以峰面积(Y)为纵坐标、对照品质量浓度(X)为横坐标，进行线性回归分析，求得回归方程为Y=6.211 X-10.04，r=0.999 6，线性范围为16.86～224.64 μg/mL。

2.3 乙醇浓度考察 取9份冬凌草粉末(过3号筛)，每份约0.3 g，精密称定后置100 mL具塞锥形瓶中，每3份分成1组，分别精密加入20 mL体积分数为75%、85%、95%的乙醇，密塞，室温下浸泡24 h，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪测定。计算出药材中冬凌草甲素含量：ρ=m1(g)/m2(g)×100%(ρ：冬凌草甲素含量，m1：冬凌草甲素重量，m2：药材重量)。表1显示，95%乙醇提取冬凌草甲素的平均含量分别是85%乙醇和75%乙醇的1.15倍和1.29倍，故本实验选择95%乙醇作为提取溶剂。

2.4 正交试验设计提取工艺 冬凌草饮片除去杂质后的0.5～2 cm干燥小段。冬凌草粗粉：冬凌草用高速粉碎机粉碎，全部通过2号筛，能通过4号筛的粉末占30%。冬凌草细粉：全部通过5号筛，能通过6号筛的粉末占98%。选用体积分数95%乙醇作为溶剂，3种规格的冬凌草药材均为1 g(精确到0.000 1 g)，共27份，每3份为1组，按正交条件进行试验。试验结束后冷浸液滤过，再用5 mL新鲜溶剂洗涤滤纸及漏斗，合并滤液后用旋转蒸发仪减压蒸发至近干，用甲醇溶解残渣，移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤后精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪测定。因素与水平见表2。

表1 采用不同乙醇浓度冷浸时冬凌草甲素含量(%)

表2 因素与水平表

2.5 正交试验结果与方差分析 表3试验结果表明,根据R值的大小，各因素对冬凌草提取效果的影响程度从大到小依次为D>A>B>C，即药材规格是最主要因素，其次是溶剂用量和冷浸时间，而提取次数为最次要因素。根据极差分析中各水平的冬凌草甲素含量大小，直观分析出较优工艺组合应为A3B2C2D3。

将正交试验结果进行方差分析。表4结果显示，A(乙醇用量)、B(冷浸时间)、C(提取次数) 和D(药材规格)对冬凌草甲素的提取均有显著性影响。通过考察各因素均数间的多重比较结果，发现A因素的2水平和3水平之间并无显著性差异(P>0.05)，但2水平具有节约成本和缩短浓缩时间的优势，因而确定提取工艺为A2B2C2D3，即冬凌草粉碎成细粉规格，加入15倍量体积分数95%乙醇，提取2次，每次4 d。

表3 正交试验设计与结果(n=3)

表4 方差分析结果

注：F0.05(2，18)=3.55，F0.01(2，18)=6.01

2.6 工艺验证试验 取冬凌草细粉3份，每份100 g，按上述最佳冷浸条件进行验证试验，即药材粉碎至细粉，用15倍量体积分数95%乙醇冷浸提取2次，每次4 d，分别测定冬凌草甲素提取量，验证结果见表5。3次结果都处于较高水平，说明该提取工艺是稳定可行的。

表5 工艺验证试验结果(n=3)

2.7 方法学考察

2.7.1 精密度实验 精密吸取浓度为112.32 μg/mL的对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，结果冬凌草甲素峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.26%，说明仪器性能良好。

2.7.2 重复性实验 取同一批冬凌草药材细粉6份，每份1 g，精密称定，按上述最佳冷浸条件操作，其余步骤按“2.4”项所示步骤制成供试品溶液，RSD=2.85%，说明该方法重复性良好。

2.7.3 稳定性实验 取同一份冬凌草供试品溶液，25 ℃下放置，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，冬凌草甲素峰面积的RSD=0.52%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7.4 加标回收率实验 取冬凌草药材细粉0.5 g，精密称定后置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入30 mL体积分数为95%的乙醇，密塞，室温下浸泡24 h，测得浸出液中冬凌草甲素含量为76.67 μg/mL。准确吸取该浸出液1.0 mL，共9份，均分3组，每组为同一个浓度，置5 mL容量瓶中，三组分别加入冬凌草甲素对照品77.22、193.05、386.1 μg，相当于供试液中冬凌草甲素含量的1、2.5、5倍，甲醇定容后混匀，滤过，取续滤液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，低、中、高3种质量浓度的平均加标回收率分别为103.07%、101.32%、99.74%，RSD分别为1.27%、0.67%、0.83%(n=3)，表明该测定方法的加标回收率较好，符合含量测定的要求。

3 讨论

为了确定冬凌草冷浸提取法的最佳提取条件，本文选取乙醇用量、冷浸时间、提取次数和药材规格4个因素进行考察。结果显示，药材规格因素对冬凌草提取效果的影响程度最大，即为最主要因素。药材中的有效成分一般需要经过浸润、溶胀、渗透和扩散等阶段才能溶出，大量研究表明，该过程不但跟溶剂种类、溶剂用量、提取时间等因素相关，药材的粒度亦是重要影响因素[12]。药材粉碎成细粉规格后，粒度明显减少，大大增加了比表面积，有利于有效成分浸出，因而有助于缩短提取时间及提高提取率。

药材规格对冬凌草的提取起主要作用，是影响提取效果的最重要因素；其次是溶剂用量，冷浸时间和提取次数影响最小。冬凌草甲素不稳定，其含量受温度影响变化很大，受热过程越长，含量随之降低越多[13]。应综合考虑正交试验的极差分析和方差分析结果，选择适宜的溶剂因素水平，以减少乙醇用量，达到缩短有效成分受热时间和节

能降耗的两重目标。

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Optimization of cold-soaked extraction process forRabdosiarubescensby orthogonal test

JING Qi1,NI Hui-yan2,WANG Juan1,XU Hong3,YI Cheng-xue3*

(1.Zhenjiang Fifth People′s Hospital,Zhenjiang 212001,China;2.Zhenjiang Fourth People′s Hospital,Zhenjiang 212001,China;3.Zhenjiang Center for Disease Control and Prevention,Zhenjiang 212004,China)

Objective To develop an optimum process condition for cold-soaked extraction ofRabdosiarubescens.Methods The content of oridonin was determined by HPLC.The effect of different concentrations of ethanol on the extraction of oridonin fromR.rubescenswas observed.The solvent dosage,extraction time,extraction times and herbs specifications were optimized by using orthogonal test.Results Four kinds of the above factors have conspicuous effect on the content of oridonin.The optimum process conditions ofR.rubescensextraction were determined as follows:fine powder of herbs specifications,15 times of solvent dosage of 95% ethanol,extraction for 2 times,extraction for 4 d each time.Conclusion The established extraction process conditions are simple and practicable.

Rabdosiarubescens;Oridonin;Cold-soak extraction process;Orthogonal test

2017-02-04

1.镇江市第五人民医院，江苏 镇江 212001；2.镇江市第四人民医院，江苏 镇江 212001；3.镇江市疾病预防控制中心，江苏 镇江 212004

镇江市卫生科技重点专项项目(SHW2016015)；江苏省“科教强卫工程”专项经费资助(QNRC2016461)

10.14053/j.cnki.ppcr.201708019

*通信作者