任勰珂，陈莉*，卢红梅，贾青慧

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025；3.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025）

响应面法优化薏仁米糠蛋白碱提工艺的研究

任勰珂1，2，陈莉1，3*，卢红梅1，3，贾青慧2，3

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025；3.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025）

该试验以贵州兴仁县产纯种小薏仁米米糠作为研究对象，采用碱提酸沉法提取薏仁米糠中的蛋白质。考察料液比、碱提温度、碱提时间、碱提pH对蛋白提取率的影响。在单因素试验基础上，采用4因素3水平响应面优化试验，并对试验数据进行多元回归拟合分析，建立各因素对提取率的二次多项式回归预测模型，确定最佳碱提工艺参数。结果表明，碱提酸沉法提取薏仁米糠蛋白最佳提取工艺为料液比1∶22（g∶m L），碱提温度45.5℃，碱提时间3 h，碱提pH9.6，平均蛋白提取率为78.9%。

薏仁米糠蛋白；提取率；碱提酸沉法；响应面优化

薏仁米在加工成精米的过程中需去掉外壳和占总质量10%左右的种皮和胚[1]，种皮和胚加工制成的米糠是薏仁米加工的主要副产品[2]。米糠在国外被称为“天赐营养源”[3]，含有米糠蛋白、米糠油、米糠多糖、米糠植酸钙等多种营养成分[4-6]，具有较高的保健开发价值。贵州省薏仁米资源丰富，但目前大多加工企业还属于粗放型加工，精深加工缺乏，生产设备落后、技术不完善[7]，大量的糠壳等副产物仅作为低值产品直接处理销售[8]，综合利用不充分，给薏仁米生产加工企业造成了较大损失。

本研究采用贵州兴仁县产纯种小薏仁米米糠作为研究对象，采用碱提酸沉法提取薏仁米糠中的蛋白质。在单因素试验的基础上，采用响应面法优化碱提酸沉法提取工艺，确定最佳提取工艺参数，用Design-Expert软件建立各因素对提取率的二次多项式回归预测模型，以期为薏仁米糠蛋白的提取和利用提供依据和数据支撑，对推动贵州省薏仁米产业向精深加工方向发展具有积极的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

薏仁米糠：贵州兴仁县兴诚华英食品有限公司，将薏仁米糠粉碎后（粉碎度为50～300目）用30～60℃沸程的石油醚以1∶3（mg/m L）的比例在室温条件下振荡脱脂3 h，过滤，并用石油醚冲洗，放于通风厨中风干，4℃保存备用。

1.1.2 试剂

氢氧化钠、硼酸、浓盐酸、浓硫酸、石油醚、硫酸钾等（均为分析纯）、牛血清白蛋白（生化试剂）：天津市瑞金特化学品有限公司。

双缩脲试剂：1.5 g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0 g的酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）溶于500m L蒸馏水中，在搅拌条件下加入300m L 10%NaOH溶液，用水稀释至1 000m L，此试剂可长期保存。

1.2 仪器与设备

SH220石墨消解仪：济南海能仪器股份有限公司；CMD-20X恒温鼓风干燥箱：上海琅玕试验设备有限公司；HH-b型数显恒温水浴锅：常州奥华仪器有限公司；ZD-2A自动电位滴定仪：上海大普仪器有限公司；FW-80万能粉碎机：上海仕元科学器材有限公司；722S可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；80-2电动离心机：常州澳华仪器有限公司；CJJ-781磁力加热搅拌器：城西晓阳电子仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 薏仁米糠蛋白提取工艺流程

脱脂薏仁米糠→碱液浸泡提取→离心→上清液等电点沉淀→静置、离心→沉淀物→水洗至中性→真空干燥→薏仁米糠蛋白

1.3.2 单因素试验

固定其他条件不变，分别考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶m L））；碱提pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0）；碱提温度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃）；碱提时间（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h）对薏仁米糠蛋白提取率的影响。

1.3.3 响应面试验

在单因素试验的基础上，以薏仁米糠蛋白提取率（Y）为评价指标，采用Box-Behnken中心组合设计原理，设计4因素3水平的响应面优化试验[9]，对碱提pH（A）、碱提温度（B）、碱提时间（C）、料液比（D）进行响应面分析，因素与水平如表1所示。再用Design-Expert软件对试验数据进行多元回归拟合分析，对所得模型进行失拟性检验、方差分析[10]，确定碱提酸沉法提取薏仁米糠蛋白的最佳工艺条件。

表1 碱提酸沉法提取薏仁米糠蛋白响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction conditions optim ization o f adlay bran protein by alkaliextraction and acid precipitation method

1.3.4 测定方法

薏仁米糠蛋白等电点的确定：取蛋白提取液20m L，用15%HCl溶液调节pH值分别为3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0，4 000 r/min离心15min，采用双缩脲法测出各上清液的蛋白含量，以pH为横坐标，蛋白质量浓度（mg/m L）为纵坐标，绘制蛋白质量浓度-pH标准曲线。

蛋白含量：参照参考文献[11]的方法进行测定。蛋白提取率计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 薏仁米糠蛋白等电点确定

2.1.1 牛血清蛋白标准曲线

图1 牛血清白蛋白标准曲线Fig.1 Standard curve of bovine serum album in

由图1可知，牛血清白蛋白质量浓度在0～10mg/m L范围内与吸光度值具有良好的线性关系，标准曲线的线性回归方程为y=0.053 7x-0.008 1，相关系数R2=0.999 2。

2.1.2 薏仁米糠蛋白等电点测定

图2 薏仁米糠蛋白等电点测定结果Fig.2 Determ ination resu lts of isoelectric point of adlay bran protein

由图2可知，蛋白提取液在不同pH条件下，经离心沉淀后，当pH值为4.2时上清液中残留的蛋白质量浓度最低，为2.526mg/m L，表明在此pH条件下大部分蛋白质已经沉淀，因此薏仁米糠蛋白等电点为pH4.2。

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对薏仁米糠蛋白提取率的影响

由图3可知，随着料液比的增加，薏仁米糠蛋白提取率呈现先增加后降低的趋势。在料液比为1∶10（g∶m L）时，提取率最低为46.99%；在料液比为1∶20（g∶m L）时，薏仁米糠蛋白提取率达最大值为76.63%，这可能是因为在料液比较低时，提取液黏度较大，分子扩散速率较低，则蛋白分子溶出率低，导致提取率较低；随着料液比的增大，提取液黏度降低，蛋白分子溶出率增加，提取率增加[18]。继续增大料液比，蛋白提取率反而下降。因此选择料液比为1∶20（g∶m L）进行后续试验。

图3 料液比对薏仁米糠蛋白提取率的影响Fig.3 Effect ofm aterial-liquid ratio on extraction rate of ad lay bran protein

2.2.2 碱提pH对薏仁米糠蛋白提取率的影响

图4 碱提pH对薏仁米糠蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of alkaliextraction pH on extraction rate of adlay bran protein

由图4可知，随着碱提pH值的增加，薏仁米糠蛋白提取率呈现先增加后减少的趋势。在pH值为7.5时，薏仁米糠蛋白提取率较低；当pH值为9.5时，薏仁米糠蛋白提取率达到最高为77.04%，可能是因为薏仁米糠蛋白中大量的二硫键和疏水基团使其溶解性下降，而碱液对蛋白质分子中氢键具有破坏作用，并可使某些极性基团发生解离，使蛋白质表面分子带相同电荷，从而提高蛋白质分子的溶出，所以随着pH的不断增大，薏仁米糠蛋白的提取率也不断增大[12]。但pH过高，会对蛋白质量造成不良影响，降低其营养价值，因此选择碱提pH为9.5进行后续试验。

2.2.3 碱提温度对薏仁米糠蛋白提取率的影响

由图5可知，随着碱提温度的升高，薏仁米糠蛋白提取率呈现先增加后降低的趋势。在35～45℃时，随着温度的增加，薏仁米糠蛋白提取率增加，当碱提温度为45℃时，薏仁米糠蛋白提取率达到最高为48.54%；继续升高碱提温度，薏仁米糠蛋白提取率有所下降，这可能是热动能的增加，使蛋白质结构展开、非极性集基团暴露，聚集和沉降作用使蛋白溶解度降低[13]。因此选择碱提温度为45℃进行后续试验。

图5 碱提温度对薏仁米糠蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of alkaliextraction temperature on extraction rate of adlay bran protein

2.2.4 碱提时间对薏仁米糠蛋白提取率的影响

图6 碱提时间对薏仁米糠蛋白提取率的影响Fig.6 Effect of a lkaliextraction time on extraction rate o f ad lay bran protein

由图6可知，随着提取时间的增加，薏仁米糠蛋白提取率呈现先增加后降低的趋势。当碱提时间为3.0 h时，薏仁米糠蛋白提取率达到最高为57.05%；继续延长碱提时间，薏仁米糠蛋白提取率逐渐降低。出现这样的变化趋势可能是因为随着时间的延长，薏仁米糠蛋白不断被溶出，提取率不断增加，达到一定的时间，溶解量达到最大值，继续延长时间，部分蛋白发生水解，导致提取率降低[14-16]。因此选择碱提时间为3.0 h进行后续试验。

2.3 响应面试验

2.3.1 响应面试验结果

用Design-Expert软件对试验数据进行多元回归拟合分析，得料液比（A）、碱提pH（B）、碱提温度（C）、碱提时间（D）的二次多项回归方程为：Y=82.71+3.54A+1.47B+0.65C+ 2.46D+1.76AB-0.25AC-0.81AD-1.13BC-0.21CD-4.18A2-8.48B2-4.36C2-8.24D2。

由表4、表5可知，对所得模型进行失拟性检验、方差分析显示：该模型的一次项和交互项显著（P＜0.05），平方项和立方项不显著（P＞0.05）。在本试验所涉及范围内，模型的P值＜0.000 1，模型极显著；失拟项P=0.109 0＞0.05，失拟项不显著，方程拟合不足，检验不显著，无其他因素影响本试验，说明该模型能够较好的反应各个因素的变化对薏仁米糠蛋白提取率造成的影响。由F值可得，各个因素对蛋白提取率影响的主次顺序为：料液比＞碱提时间＞碱提pH＞碱提温度。各系数方差分析结果表明，料液比、碱提pH影响极显著（P＜0.01），碱提时间影响显著，碱提温度影响不显著；在交互作用中，碱提pH和碱提温度交互作用显著（P＜0.05），其他交互作用均不显著（P＞0.05）；在二次项中，碱提pH、碱提温度、碱提时间、料液比影响都极显著（P＜0.01）。

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 模型的失拟性检验Table 4 Loss-faulty determ ination of the model

表5 二次多项式模型的方差分析Table 5 Variance analysis of quadratic polynom ialm odel

2.3.2 响应面最优结果

为了进一步研究相关变量间的交换作用以及确定最优点，通过Design-ExpertV8.0.6软件绘制响应面曲线图进行可视化分析，结果见图7。

由图7可知，6组以薏仁米糠蛋白提取率为响应值的趋势图，其等高线图可直观反应出两变量交互作用的显著程度，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形表示两因素交互作用显著。由图7可知碱提pH和碱提温度的交互作用对蛋白提取率的影响最为显著（P＜0.05）。以蛋白提取率最大为目标，应用响应面分析软件进行预测，对各因素在试验范围内进行最优化处理，得到薏仁米糠蛋白碱提酸沉法最佳提取工艺为料液比1∶21.74（g∶m L），酶解温度45.49℃，碱提时间2.96 h，碱提pH9.62，在此条件下薏仁米糠蛋白平均提取率为80.39%。

2.3.3 最佳工艺条件的验证

为了进一步验证模型预测的最佳工艺条件的准确性，并且为了方便实际操作，将提取工艺修正为料液比1∶22（g∶m L），碱提温度45.5℃，碱提时间3 h，碱提pH 9.6。在上述最佳工艺条件下，进行3次验证试验，得到薏仁米糠蛋白提取率分别为78.2%、79.3%，79.2%，平均提取率为78.9%，与模型理论值相接近。说明利用该模型可以较好的预测薏仁米糠蛋白的提取条件。

图7 料液比、碱提时间、碱提pH、碱提温度交互作用对薏仁米糠蛋白提取率影响的响应面图及等高线Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between material-liquid ratio,alkaliextraction time, pH and temperature on extraction rate of adlay bran protein

3 结论

本试验利用薏仁副产物—薏仁米糠，通过碱提酸沉法提取薏仁米糠蛋白。运用Design-Expert建立各因素对提取率的二次多项式回归预测模型，并提取工艺进行响应面优化。试验表明料液比、碱提pH影响极显著（P＜0.01），碱提时间影响显著（P＜0.05），碱提pH和碱提温度交互作用显著P＜0.05），这几个因素对蛋白提取率的影响非简单的线性关系。经回归分析及检验表明，此法合理可行，最佳工艺条件为料液比1∶22（g∶m L），碱提温度45.5℃，碱提时间3 h，碱提pH 9.6。此最佳条件下平均蛋白质提取率为78.9%。

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Optim ization ofalkaliextraction processofadlay bran protein by response surfacemethodology

REN Xieke1,2,CHEN Li1,3*,LU Hongmei1,3,JIA Qinghui2,3
(1.SchoolofLiquorand Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.College ofChem istry and Chem icalEngineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.Key Laboratory ofFermentation Engineering and BiologicalPharmacy ofGuizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Using the adlay bran from Guizhou Xingren county as research object,the protein in adlay branwasextracted by alkaliextraction and acid precipitationmethod.The effectsofmaterial-liquid ratio,alkaliextraction temperature,timeand pH on protein extraction ratewere investigated.On the basis of single factor experiments,the quadratic polynom ial regressionmodelwas established by 4 factors and 3 levels response surface experimentsoptimizationandmultiple regression fittinganalysis.Theoptimum alkaliextraction conditionswere identified asmaterial-liquid ratio1∶22(g∶m l), alkaliextraction temperature45.5℃,time3 h and pH 9.6.Under the conditions,theaverage protein extraction ratewas78.9%.

adlay bran protein;extraction rate;alkaliextraction and acid precipitationmethod;responsesurfaceoptimization

TS201.3

0254-5071（2017）08-0099-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.022

2017-03-29

贵州省科技合作计划（LH[2015]7668）

任勰珂（1992-），女，硕士研究生，研究方向为微生物发酵。

*通讯作者：陈莉（1981-），女，副教授，硕士，研究方向为微生物发酵。