王玉超，李保全＊ ，胡东方，古金元，陈同煜，彭 涛，刘思当，肖一红

(山东农业大学，山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，山东 泰安 271000）

一例典型猪瘟病例的综合诊断

王玉超，李保全＊ ，胡东方，古金元，陈同煜，彭 涛，刘思当，肖一红

(山东农业大学，山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，山东 泰安 271000）

2016年12月山东泰安某养殖户的70头育肥猪，部分猪出现了高烧不退、弓背喜卧、眼角分泌物增多、粪便干结、全身皮肤点状出血等疑似猪瘟症状；病理剖检可见全身皮肤、浆膜、肾、胃肠黏膜、肺等器官组织广泛性渗出性出血；采集病猪病料，提取RNA，用猪瘟病毒基因特异性引物进行RT-PCR，琼脂糖凝胶电泳结果显示，病料呈猪瘟病毒核酸阳性，确诊该病例为猪瘟病毒的急性感染。

猪瘟；剖检；组织病理学；RT-PCR检测

猪瘟又称经典猪瘟或古典猪瘟（Classical swine fever，CSF或hog cholera），是猪的一种高度传染性疾病。在我国俗称烂肠瘟。为世界动物卫生组织所列的A类16种法定传染病之一。猪是自然条件下对猪瘟病毒唯一易感的动物，传播途径主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。消化道、鼻腔黏膜和破损的皮肤均为感染途径。一年四季都可发生，以春夏多雨季节多发。是目前威胁我国养猪业的主要传染病之一。自然感染的潜伏期常为3～6 d，也有延长至24 d的。根据病程长短、临床症状和特征的不同，常将本病分为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型等4种类型。最急性型较少见，病猪体温升高，常无其他症状，1～2 d内死亡。急性型最常见，体温可上升到41 ℃以上，食欲减退或消失，可发生眼结膜炎并有脓性分泌物，鼻腔也常流出脓性黏液，间有呕吐，有时排泄物中带血液，甚至便血。初期耳根、腹部、股内侧的皮肤常有许多点状出血或较大红点。病程一般为1～2周，最后绝大多数死亡。亚急性型常见于本病流行地区，病程可延至2～3周；有的转为慢性，常拖延1～2个月。表现黏膜苍白，眼睑有出血点。皮肤出现紫斑，病猪极度消瘦。死亡以仔猪为多，成年猪有的可以耐过。非典型病猪临诊症状不明显，呈慢性，常见于“架子猪”。2016年12月，我国山东泰安某养殖户所饲养的70头育肥猪中先后出现了高烧不退、弓背喜卧、被毛粗乱、粪便干结、眼角分泌物增多，随后腹部及四肢内侧出现出血斑点等疑似猪瘟症状，猪群没有免疫猪瘟疫苗，经病理剖检和RTPCR诊断确诊为猪瘟病毒急性感染。

1 材料与方法

1.1 实验材料

病例来自山东泰安某农户饲养的育肥猪群发病猪，病猪剖检，采集淋巴结和肾脏等病变组织。病料处理：取病死猪扁桃体、淋巴结、脾脏等组织，剪碎，添加3倍灭菌生理盐水，用匀浆机研磨制成悬液；反复冻融3次；9 000 r/ min离心3 min取上清液；分子生物学试剂：RNA提取试剂盒采用北京全式金Easy Pure Viral RNA/DNA Kit（批号：K10314）。PCR相关试剂为北京全式金相关产品。根据Genbank公布的序列设计猪瘟病毒的特异性引物，扩增目标片段大小约为600bp，其序列分别为：

F-TRACCAYGCAYATGWCAGAAGTACC

R-AGTCGACTTCCCTGGTTTCACTTG

1.2 实验方法

1.2.1 临床诊断与剖检

观察和记录病猪临床症状，剖检死亡猪只，检查大体病变，并采集具有典型病变的器官组织，-80 ℃冷冻备用。

1.2.2 总RNA 提取

按照全式金Easy Pure Viral RNA/ DNA Kit 说明书进行操作：加入20 μL Proteinase K于一个无菌的1.5 mL离心管中。在高心管中加入200 μL样品。加入200 μLBB5 (包含5.6 μg CarrierRNA) ，涡旋混合15秒。56 ℃孵育15 min。加入250 μL无水乙醇(此时可能会出现絮状沉淀) ，涡旋混合15 s，室温放置5 min。将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12 000 r/min离心1 min，弃掉流出液。加入500 μL WB5， 12 000 r/ min离心1 min，弃掉流出液。再加入500 μL WB5， 12 000 r/min离心1 min，弃掉流出液。室温12 000 r/ min离心1 min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。将离心柱转入一个新1.5 mL RNase-free离心管中， 并向离心柱中加20～50 μLRNase-free Water， 室温静置1 min。室温12 000 r/min离心1 min，洗脱RNA。将RNA置于-80 ℃保存。

1.2.3 RT-PCR 反应及电泳

RT-PCR反应采取20 uL体系，反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30循环；72 ℃ 7 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测。

2 结果与分析

2.1 临床症状

送检病猪临床主要表现为极度的精神沉郁，食欲废绝，被毛粗乱，扎堆，发烧，体温在40～41℃，腹部及四肢内侧皮肤可见出血点及出血斑。

2.2 剖检病变

对死亡的猪只进行剖检，肾脏表面密布针尖大出血点（图1-A）；切面皮质部也见有点状出血（图1-B）；全身淋巴结肿大出血（图1-C）；胃黏膜散在纽扣状溃疡灶（图1-D）；病猪脾脏边缘有明显的出血性梗死灶（图1-E）；大脑膜血管充血、出血（图1-F）。

图1 病猪剖检病变

图2 病猪的组织病理学变化

图3 1%的琼脂糖凝胶电泳

2.3 病理组织学检查

将采集的组织器官病料经常规石蜡切片、HE染色后镜检，可见典型的病毒性脑炎病变，大脑血管周围有大量的淋巴细胞和单核细胞浸润形成“脑血管袖套现象”（图2-A）；肾小球体积增大，充血、出血（图2-B），肾小管上皮细胞变性、坏死，肾间质及肾髓质区充血、出血（图2-C）；脾脏出血性梗死区充满红细胞（图2-D）；淋巴结淋巴细胞崩解坏死，胞核浓缩深染、崩解破碎、溶解消失（图2-E）。

2.4 RT-PCR 结果

提取病变淋巴结和肾脏组织总RNA，用参照已发表的猪瘟病毒序列设计合成的猪瘟特异性引物，进行猪瘟病毒核酸RT-PCR检测，结果扩增了约600 bp的条带，显示病料呈猪瘟核酸阳性。

3 防治措施

1）隔离病猪。对保育舍发病猪只立即进行隔离，对发病严重、无治疗价值的病猪立即扑杀，减少病猪的排毒；禁止病猪舍饲养人员随意串舍，进出猪舍必须严格消毒。

2）严格消毒。发病猪舍立即进行带猪消毒，使用碘制剂等对猪刺激小但是效果好的消毒剂喷雾消毒，同时对猪圈及饲喂器具进行彻底消毒。

3）紧急免疫。对保育舍健康猪及假定健康猪使用猪瘟弱毒疫苗实行紧急免疫，剂量为正常免疫的2～4倍，并且保证一猪一针头，防止交叉感染，对发病猪单独进行紧急免疫，剂量为正常免疫的8～10倍，随时观察猪群情况，出现病情加重的猪只立即扑杀，无害化处理，防止散毒。

4）加强饲养管理。立即停止猪场猪只的买卖，减少猪群应激反应，保持猪圈干燥，及时清理粪污，加强通风换气，降低饲养密度。

5）调整免疫程序。对猪场种猪群（公猪、后备母猪及经产母猪）立即进行1次猪瘟疫苗普免；仔猪首免日龄改为25日龄，并且55～60日龄进行第2次免疫。

2017-02-16）

本研究由国家重点研发计划项目“猪重要疫病免疫防控新技术研究”子课题“规模化猪场科学合理的免疫程序的研究（2017YFD0500605）”支持；山东省“双一流”奖补资助。

李保全