Amide proton transfer imaging of neonatal piglet with hypoxic ischemic brain injury

Objective To investigate the amide proton transfer (APT) values in basal ganglia of neonatal piglet hypoxic-ischemic brain injury (HIBI) model using MR APT imaging. Methods Totally 35 healthy neonatal piglets were selected. There were 5 piglets underwent sham-operation in control group and 30 piglets used to established HIBI models in HIBI group. According to the time interval between APT imaging and the establishment of HIBI model, the piglets in HIBI group were divided into 0—<2 h， 2—<6 h， 6—<12 h， 12—<24 h， 24—<48 h and 48—<72 h subgroups. APT imaging was performed on all piglets. The APT value of basal ganglia between control group and all the subgroups in HIBI group were compared. Results After HIBI occurred, the APT values immediately decreased in 0—2 h， and then increased gradually. In 24 h after HIBI, the APT values were mainly returned to the level of control group, then continuously increased. The APT value in control group and 0—<2 h， 2—<6 h， 6—<12 h， 12—<24 h， 24—<48 h， 48—<72 h subgroups in HIBI group were 0.52±0.09, -0.35±0.08, -0.02±0.14, 0.28±0.04, 0.46±0.11, 0.80±0.11, 1.24±0.18, respectively. The APT values between control group and each subgroups in HIBI group had significant differences (allP<0.01) except for 12—<24 h subgroup (P=0.68). Conclusion The APT value decreased firstly and then increased after HIBI in neonatal piglet. APT imaging can provide a non-invasive molecular MR method to evaluate the pathophysiological changes of HIBI.

Brain injuries; Hypoxia-ischemia, brain; Piglet; Amide proton transfer

脑部活动所需能量大部分来自葡萄糖的有氧代谢[1]，正常代谢状态下，脑内葡萄糖及乳酸保持动态平衡，但当脑内缺氧缺血(hypoxia-ischemia, HI)时，有氧代谢障碍[2]，有氧代谢转为无氧代谢，脑组织内无氧代谢过程产生的乳酸增多，堆积的乳酸致使糖代谢受到抑制，加重细胞内酸中毒[3]。酰胺质子转移(amide proton transfer, APT)成像是一种分子水平MR成像新技术，其原理是利用特定频率的脉冲来饱和细胞内游离蛋白质和多肽上的酰胺质子，因饱和的酰胺质子与自由水质子间存在化学交换，进而产生水信号的变化[4]。理论上，APT信号强度主要取决于酰胺质子和水质子的交换速率，这种交换速率与蛋白质浓度及pH值有关。酰胺质子浓度越高，交换速率越快，APT信号强度越高；pH值越低，交换速率越慢，APT信号强度越低[5]。本研究建立新生猪急性缺氧缺血模型以模拟新生儿缺氧缺血脑损伤(hypoxic-ischemic brain injury， HIBI)病理变化，应用APT成像分析HI后新生猪脑内APT值的变化，以期为今后进一步临床无创评估脑内pH变化提供实验数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用出生后3～5天的健康Yorkshire猪共41只(由我院实验动物中心提供)，雌雄不限，体质量1.0～1.5 kg，平均(1.37±0.24)kg。排除中途死亡、建模失败及运动伪影等6只后，共35只新生猪纳入研究，随机分为对照组(n=5)和模型组(n=30)；模型组中又根据HIBI至MR扫描的间隔时间进一步分为6个时间亚组，即0～<2 h、2～<6 h、6～<12 h、12～<24 h、24～<48 h、48～<72 h亚组，每一亚组中各5只。本研究经我院医学伦理委员会审核(批号：2015PS337K)，对所有实验动物均严格执行《实验动物管理条例》和《实验动物许可证管理办法》的规定。

1.2建立HIBI实验模型

1.2.1 模型组 实验室内温度保持在28～30℃，以0.6 ml/kg体质量肌肉注射速眠新(长春军事医学院兽医研究所)麻醉实验猪后，行气管插管(直径2.5 mm)。连接TKR-200C小动物呼吸机(江西特力麻醉呼吸设备中国有限公司)，机械通气，设置呼吸机参数为：呼吸比(I/E)为1∶1.5，呼吸频率30次/分，压力0.05～0.06 MPa。采用GE TuffSat手掌式脉搏血氧仪监测心率、血氧饱和度。耳缘静脉置管固定。以碘伏消毒颈部皮肤，行颈部正中切口，分离双侧颈总动脉后，静置30 min待其状态稳定，以动脉夹阻断双侧颈总动脉血流，同时机械通入6%氧气(大连大特气体有限公司)，维持该状态40 min后，通入100%氧气(由我院医疗用品站配制)，同时恢复双侧颈动脉血供，缝合切口。全程监控血氧饱和度及心率。并及时对症处理术中及术后出现的休克及抽搐。待实验猪恢复自主呼吸后停用呼吸机。

1.2.2 对照组 实验过程同模型组，至分离双侧颈总动脉后，缝合切口。将实验猪置于保温箱内保持体温。

1.3 APT图像采集及处理

1.3.1 APT成像 采用Philips Achieva 3.0T MR扫描仪，笔形束扫描，二阶匀场，体线圈发射信号，8通道头线圈接收信号。APT序列扫描前先行常规MR扫描，获得冠状位T1WI、T2WI及矢状位T1WI图像，用于观察脑形态及APT成像定位。对模型组不同亚组按分组中规定的时间进行扫描，对照组假手术操作后待实验猪恢复自主呼吸后进行扫描。在扫描时需注意保持体温，以避免温度对实验结果的影响。对模型组术后尚未恢复自主呼吸的实验猪进行扫描时，以人工抱球代替呼吸机维持其呼吸。

对各组实验猪均采用冠状位T2WI进行APT成像定位，定位于显示基底核最大层面。而后行APT单层成像采集轴位基底核图像，在2 μT能级上饱和时间为500 ms(该时间目前对于该体线圈为最长[6])，采集方式为TSE序列，TSE factor为38，扫描±3.50 ppm两个化学位移处，重复8次以提高信噪比，TR 4 000 ms，TE 8.1 ms，矩阵108×71，FOV 170 mm×145 mm，层厚5 mm，扫描时间约4 min 16 s。APT成像采用多次射频脉冲激励多次采集的方法[7]，采集过程中，在距离水的共振频率不同位置处[0、±0.25 ppm、±0.50 ppm、±0.75 ppm、±1.00 ppm、±1.50 ppm、±2.00 ppm、±2.50 ppm、±3.00 ppm(采集2次)、±3.25 ppm(采集4次)、±3.50 ppm(采集8次)、±3.75 ppm(采集4次)、±4.00 ppm(采集2次)、±4.50 ppm、±5.00 ppm、±6.00 ppm]，共采集31个频率饱和射频脉冲，以未施加射频激励的图像作为标准化图像。

1.3.2 APT数据后处理 采集到的APT原始数据通过交互式数据分析语言中的IDL程序(Boulder公司，美国)进行分析测量并重建出伪彩图。首先获得基于体素的Z谱，通过1个12阶的多项式拟合，获得Z谱最低点的位置，得到B0场的不均匀分布，从而对Z谱进行场校正。在经过校正后的Z谱取左右对称的±3.5 ppm数据点，进行非均匀性分析：MTRasym (3.50 ppm)=Ssat/S0(-3.50 ppm)-Ssat/S0(3.50 ppm)，其中MTRasym为非对称磁化传递率，Ssat为施加射频脉冲激励后的信号强度，S0为未施加射频脉冲激励的信号强度。最终获得APT加权MR成像数据，以APT值反映APT加权效应。

1.3.3 ROI选择 由2名高年资影像诊断医师对经图像后处理所获得的APT图像进行定量分析。在数据处理过程中，结合常规冠状位T1WI、T2WI及矢状位T1WI图像所示解剖结构，在APT图像中选择双侧基底核(图1)作为ROI[8]，选取ROI时注意避开脑脊液，每个ROI测量3次，取平均值作为最终该ROI的APT值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0统计分析软件，计量资料以±s表示。采用配对样本t检验比较左、右侧基底核APT值的差异，如左、右侧差异无统计学意义，则将双侧APT值的平均值作为各组最终APT值纳入分析。采用单因素方差分析比较对照组及模型组各亚组间基底核APT值的差异，两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对照组及模型组不同时间各亚组中，实验猪左、右两侧基底核APT值差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。模型组HIBI再灌注后及对照组实验猪基底核APT值随时间变化的散点图见图2，模型组实验猪基底核APT值在HIBI后0～2 h急剧下降，而后逐渐升高，24 h左右基本恢复至对照组水平。对照组及模型组0～<2 h、2～<6 h、6～<12 h、12～<24 h、24～<48 h、48～<72 h亚组平均APT值分别为0.52±0.09、-0.35±0.08、-0.02±0.14、0.28±0.04、0.46±0.11、0.80±0.11、1.24±0.18，见图3。各组总体差异有统计学意义(F=104.87，P<0.01)，除12～<24 h亚组外(P=0.68)，模型组其余各亚组与对照组间APT值差异均有统计学意义(P均<0.01)。

表1 对照组及模型组不同时间各亚组实验猪左、右两侧基底核APT值比较(±s)

表1 对照组及模型组不同时间各亚组实验猪左、右两侧基底核APT值比较(±s)

组别实验猪基底核APT值左侧右侧t值P值模型组 0～<2h亚组-0．31±0．14-0．39±0．11-0．170．87 2～<6h亚组-0．02±0．07-0．02±0．09-0．510．64 6～<12h亚组0．27±0．100．29±0．130．890．43 12～<24h亚组0．46±0．130．46±0．140．480．66 24～<48h亚组0．76±0．200．84±0．24-1．250．28 48～<72h亚组1．26±0．081．22±0．070．350．75对照组0．55±0．130．49±0．160．170．88

图1 新生猪HIBI模型APT成像ROI选择 A.冠状位T2WI； B.冠状位T1WI； C.轴位APT图像 (虚线示双侧基底核ROI范围)

图2 HIBI后新生猪基底核APT值随时间的变化 (对照组时间点设置为0)

图3 对照组与HIBI模型不同时间亚组基底核APT值 (对照组时间点设置为0)

3 讨论

HIBI是围产期多种原因引起的脑组织HI的脑部病变，是一种全脑HI后再灌注性脑损伤。当脑组织由低灌注转移到再灌注时，会出现一系列病理生理改变，代谢变化往往早于形态学改变，观察代谢物的变化有助于早期发现疾病。因此，一种适合新生儿的无创的MR检查方法对评估HIBI引起的脑内分子水平的病理生理变化十分必要。

脑内pH的调节至关重要，脑内蛋白质的结构及酶的作用尤为明显，哺乳动物脑组织细胞内pH值约7.2～7.3，细胞外pH值约7.3～7.4[9]。HI后脑组织出现酸中毒，细胞内酸中毒不仅由乳酸堆积引起，在HIBI急性期，糖的有氧代谢发生障碍，细胞膜无法维持正常的离子泵功能，导致H+潴留在细胞内；因此HIBI再灌注早期时，细胞内H+增多，pH下降[4]。Zhou等[4]利用小鼠大脑中动脉闭塞模型进行研究，发现病变区的pH值在HI前后变化显著，而酰胺浓度在HI前后无明显变化；且pH值每改变0.5个单位，酰胺质子与自由水质子的交换速率会发生50%～70%的改变。假定在HI短时间内脑内蛋白质浓度(酰胺浓度)不变的情况下，APT信号的变化与pH相关，这种信号变化则反映了HIBI再灌注后短时间内(0～2 h)脑组织细胞内pH下降。本研究结果显示，HIBI再灌注后0～2 h，APT值呈急剧下降的趋势。HI脑组织在短暂的pH下降后，可因碱中毒导致pH迅速升高，有学者[10]将这种脑组织细胞内碱中毒解释为脑脊液的部分容积效应。本研究显示HIBI后24 h，APT逐渐恢复至正常，并继续升高。碱中毒患者预后较差[11]。体外实验[12]表明，对碱中毒及时干预可对神经起到保护作用。影像学检查病变区的改变与组织学结果相一致，这使APT成像应用于HIBI成为可能。

有研究[13-14]报道，出生2周内的重度HIBI患儿脑细胞内pH要高于同期正常新生儿。这种脑组织的碱中毒对神经细胞的存活有害[14]，而这种损害的发生可能是由于碱性激酶A的磷脂酶和蛋白酶激活，碱性状态下增多的N-甲基-D-天冬氨酸受体加重兴奋性神经元损伤。

本研究中，APT成像选择基底核作为ROI，是由于基底核为氧代谢旺盛区，对缺氧尤为敏感，该区域最易受HI的损伤[15]。

本研究的局限性：①本研究应用的APT成像序列是单层成像，仅选择轴位基底核层面，因此对其他部位及结构的HI损伤情况未能显示；②受限于解剖结构、分辨率等原因，ROI仅选择基底核区，脑内其他区域，如皮层、皮层下白质及海马等，未进行评价。③虽然采用非对称分析的方法提取APT效应(该方法能去除直接水饱和效应及半固态磁化传递效应)，但或多或少会受低场的核欧沃豪斯效应[16]影响。

总之，新生猪脑内APT值随HIBI不同时相呈现出先下降后上升的变化趋势，有望为今后进一步应用APT成像评价新生儿HIBI脑内酸碱度等病理生理变化的提供参考。

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郑阳(1987—)，女，辽宁沈阳人，博士，医师。研究方向：中枢神经系统影像学。E-mail: zhengyang19871114@163.com

王晓明，中国医科大学附属盛京医院放射科，110004。E-mail: wangxm024@163.com

2016-11-15

2017-05-26

ZHENGYang,WANGXiaoming*

(DepartmentofRadiology,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity，Shenyang110004，China)

新生猪缺氧缺血脑损伤后酰胺质子转移成像

郑 阳，王晓明*

(中国医科大学附属盛京医院放射科，辽宁 沈阳 110004)

目的 探讨不同时间点新生猪缺氧缺血脑损伤(HIBI)模型酰胺质子转移(APT)成像基底核APT值的变化。方法 选用出生后3～5天的健康新生猪35只，分为对照组(n=5)及模型组(n=30)，分别进行假手术(对照组)及HIBI建模操作。其中模型组依据MR扫描和建立HIBI模型的间隔时间分为0～<2 h、2～<6 h、6～<12 h、12～<24 h、24～<48 h、48～<72 h亚组。对各组均行APT成像，测量双侧基底核APT值。比较对照组及模型组各亚组间基底核APT值的差异。结果 新生猪HIBI后0～2 h，APT值出现急剧下降，随后逐渐升高，24 h左右基本恢复至对照组水平。对照组及模型组0～<2 h、2～<6 h、6～<12 h、12～<24 h、24～<48 h、48～<72 h亚组平均APT值分别为0.52±0.09、-0.35±0.08、-0.02±0.14、0.28±0.04、0.46±0.11、0.80±0.11、1.24±0.18。除12～<24 h亚组外(P=0.68)，模型组其余各亚组与对照组间APT值差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论 APT值在新生猪HIBI后呈现先下降后上升的变化趋势，有望为今后进一步临床研究HIBI患儿脑内病理生理变化提供参考依据。

脑损伤；缺氧缺血，脑；新生猪；酰胺质子转移

R445.2; R-332

A

1003-3289(2017)08-1153-05

10.13929/j.1003-3289.201611080