李晓喆，赖新生

（广州中医药大学针灸康复临床医学院，广州 510405）

针刺太冲穴对自发性高血压大鼠小脑差异蛋白表达的影响

李晓喆，赖新生*

（广州中医药大学针灸康复临床医学院，广州 510405）

目的 探讨针刺太冲穴对自发性高血压（SHR）大鼠小脑差异蛋白表达的影响。方法 选用SHR大鼠55只，随机分为模型组、非穴组、曲泉组、太冲组、冲阳组5组，每组11只；另取Wistar大鼠8只，作为正常组。模型组和正常组只抓取不针刺，其余4组相应针刺曲泉穴、太冲穴、非穴和冲阳穴，1次/d，共7 d，记录实验前后各组小鼠的血压变化，后将小鼠处死取材，获得小脑组织，通过双向电泳和质谱检测观察蛋白表达结果。结果 治疗前后血压对比模型组的血压有显著升高（P＜0.05），太冲组舒张压呈下降趋势，其他针刺组的收缩压和舒张压有略微升高，但均无统计学意义（P＞0.05）；双向电泳和质谱结果显示太冲穴组针刺后小脑区蛋白表达点上调明显多于曲泉组、冲阳组及非穴组。结论 针刺太冲穴后促使小脑组织蛋白表达发生差异性变化，其差异蛋白点功能包括促进代谢产物如过氧化物的消除、加快遗传信息转化、促进神经再生等，为神经－内分泌－免疫网络假说提供佐证。

穴，太冲；SHR；小脑；蛋白表达

高血压是临床中最常见的一种慢性疾病，是心脑血管疾病中最为主要的危险因素之一。当前我国的患高血压病的患者数量增加迅速，甚至仍然呈现增长的态势[1-3]。针灸作为一种非药物疗法在治疗高血压上也发挥着显著的疗效，其降压机制尚不明确，笔者通过研究针刺太冲穴在自发性高血压大鼠小脑差异蛋白的表达，探究经穴治疗效应的特异性，并为神经－内分泌－免疫网络假说提供佐证。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用SPF级9周龄雄性Wistar大鼠8只，大鼠体质量范围180～200 g（由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证编号11400700086589），SPF级9周龄雄性自发性高血压大鼠55只，大鼠体质量范围180～200 g（由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证编号114007000865901）。实验动物由广州中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室专人饲养管理，控制动物实验室温度，保持在20～25 ℃，湿度保持在60%～80%，每日定时进行通风，避免噪音强光。

1.2 仪器与试剂 环球牌7 mm×0.30 mm无菌针灸针；无创血压测量分析系统，ALC-NIBP（上海奥尔科特生物科技有限公司）；手术刀；镊子；1.5 mLEP管；移液器；去离子水；分光光度计（上海光谱仪器有限公司 Spectrum SHANHAI 765Pc）；胎牛血清标准品BSA（浓度为5 µg/µL）（Sigma）；Bradford染液(595 nm)；甲醇（清洗比色皿）；二硫苏糖醇DTT (GE)；IPG Buffer（pH4-7) (GE)；溴酚蓝Bromophenol blue solution（300× BPB）；再水化液 RB；冷冻离心机（珠海黑马医学仪器有限公司Hema medical instrument Co.， LTDHema TGL-18R)；水平摇床；染色盘；烧杯；量筒；移液器(1 000 µL)；磁力搅拌器；计时器；扫描仪(UMAX Powerlook1100)；美国ABI4800 MALDI-TOF-TOF质谱仪等。

1.3 方法

1.3.1 分组与血压的测量 使用随机数字表法将SHR大鼠随机分为模型组、非穴组、曲泉组、太冲组、冲阳组5组，每组11只，另取8只Wistar大鼠作为正常对照组。各组大鼠在实验室内适应性饲养1周后，使用无创血压测量分析系统记录治疗前的血压，模型组和正常对照组只抓取不针刺，其余4组相应针刺曲泉穴、太冲穴、非穴和冲阳穴，1次/d，共7 d，再次测量实验后各组小鼠的血压变化。

1.3.2 取材 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后开胸、充分暴露大鼠心脏，剪开右心耳，开放静脉血，从左心室注入50～100 mL 4 ℃冰生理盐水，以流出血液变白及心脏颜色变浅为度。紧贴枕骨下缘断头，除去枕后肌肉，用弯嵌仔细剔除颅骨，取脑。在冰块上，用手术刀切除小脑，迅速放入试管内，-80 ℃保存。在研钵中倒入液氮预冷，然后将大块的组织切细后置于研钵中，迅速加入液氮。加入400 μL 裂解液，充分溶解（收集）粉末后转移至1.5 mL EP管中。超声处理后放于冰上冷却，破碎核酸，4 ℃，12 000 r/min，离心20 min，收集上清液，加入1 mL丙酮-20 ℃沉淀过夜。沉淀完的蛋白质于4 ℃，12 000 r/min，离心20 min，倒去上清液，打开管盖平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块。

1.3.3 双向电泳及质谱检测 二向电泳的程序为：S1 2 W/gel 45 min、S2 17 W/gel 直到溴酚蓝跑到底。利用美国ABI4800 MALDI-TOF-TOF质谱仪进行质谱分析，UV波长为355 nm，重复速率为200 HZ，加速电压为20 000 V，最优质量分辨率为1 500 Da；扫描质量范围为700～3 200 Da，收集信号；胰酶自切峰为内标校正质谱仪；所有实验样品的质谱图均以用默认模式获得。

2 结果

2.1 各组血压变化 见表1。

表1 各组大鼠治疗前后血压对比(x±s ，n=11) mmHg

2.2 各组蛋白点表达差异比较 见表2。

表2 各组蛋白点表达的差异比较

2.3 质谱检测 利用美国ABI4800 MALDI-TOF-TOF质谱仪进行质谱分析，根据结果搜索NCBI数据库，共鉴定出36个差异斑点蛋白。

2.3.1 Wistar组与模型组的组间比较 见表3，表4。

表3 Wistar组小脑区表达上调蛋白鉴定结果

2.3.2 曲泉组与模型组的组间比较 曲泉组小脑区表达上调蛋白鉴定结果：检测出1个蛋白点，C02(Protein Sf3a3)。曲泉组小脑区表达下调蛋白鉴定结果：检测出1个蛋白点，D01(突触结合蛋白)。

2.3.3 太冲组与模型组的组间比较 太冲组小脑区表达上调蛋白鉴定结果：共8个蛋白点，分别为F14、F15、F18、F23、F28、F33、F35、F47。F14(核糖核蛋白)、F15(Protein Tom1l2)、F18(Protein Usp14)、F23(V型质子ATP酶亚基B，脑亚型)、F28(Protein Sept4)、F33(膜联蛋白)、F35(转录激活蛋白-α[片段])、F47(过氧化物酶)。太冲组小脑区表达下调蛋白鉴定结果：共3个蛋白点，分别为E20、E31、E43。E20(钙网蛋白)、E31(Protein Setd7)、E43(Hsp90 co-chaperone Cdc37)。

表4 模型组小脑区表达上调蛋白鉴定结果

2.3.4 非穴组与模型组的组间比较 非穴组小脑区表达上调蛋白鉴定结果：共1个蛋白点，H01(Thimet寡肽)。非穴组小脑区表达下调蛋白鉴定结果：共4个蛋白点，分别为G10、G11、G24、G39。G10(Group specifc component)、G11(神经丝蛋白轻链多肽)、G24(蛋白磷酸酶1调节亚基7)、G39(Uncharacterized protein)。

2.3.5 冲阳组与模型组的组间比较 冲阳组小脑区表达上调蛋白鉴定结果：共1个蛋白点，J01(Thimet寡肽)；冲阳组小脑区表达下调蛋白鉴定结果：共2个蛋白点，分别为I09、I31。I09(Endophilin-B2)、I31(血影蛋白α链，非红细胞1)。

3 讨论

通过观察各组大鼠治疗前后血压变化发现在短时间内（7 d）针刺对SHR大鼠的血压没有明显的改善作用，但是太冲组治疗后舒张压呈现出下降的趋势而其余各组均出现上升趋势，这说明针刺太冲的降压作用可能体现在改善大鼠的舒张压。

近年来很多学者[5-13]在研究针刺太冲治疗高血压，并推测针刺太冲穴的降压机制可能与降低SHR大鼠血浆内皮素和升高血清一氧化氮的含量有关。通过观察蛋白点表达差异发现针刺太冲后大鼠小脑内蛋白点表达差异与其他组均呈现出明显的差异。

与自发性高血压大鼠相比，正常大鼠A01、A02、A10、A12、A21、A22、A23蛋白表达较为活跃，其中胞浆10 -甲酰脱氢酶有利于调节遗传信息代谢、抗肿瘤细胞增生；单向复合物Mic60与线粒体能量代谢相关且起正向作用；蛋白质二硫键异构酶A3催化蛋白构想，协同参与免疫应答。在未患病的正常大鼠中，促进代谢与加强免疫的酶的分泌明显多于SHR模型组，提示除了血压差异外，SHR大鼠的神经－内分泌－免疫调节网络也发生了功能失常。

太冲组针刺后表达上调的蛋白中，核糖核蛋白影响mRNA的前处理和mRNA代谢和转运的其他方面；V型质子ATP酶亚基B，脑型；为液泡ATP酶外周V1复合物的非催化亚基。V-ATP酶负责酸化多种在真核细胞胞内隔室；膜联蛋白A7，钙-磷脂结合蛋白，功能为促进膜融合，并参与胞吐过程；转录激活蛋白- α（片段），在DNA复制的开始和重组过程中可以发挥作用；过氧化物酶-2，参与细胞的氧化还原调节过程，在消除代谢过程中产生的过氧化物时，该酶起到了重要作用。通过调节过氧化氢的细胞内浓度，进而参与生长因子和肿瘤坏死因子- α的信号级联。此组蛋白酶协同增强脑组织的代谢，促进神经组织增生，或可为改善脑组织微环境提供依据。通过神经－内分泌－免疫调节网络来改善大鼠的舒张压[14-18]。

综上，针刺太冲穴后促使小脑组织蛋白表达发生差异性变化，其差异蛋白点功能包括促进代谢产物如过氧化物的消除、加快遗传信息转化、促进神经再生等，能够为神经－内分泌－免疫网络假说提供了佐证。

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Study on the expression of acupuncture Taichong in spontaneously hypertensive ratscerebellar proteins

LI Xiaozhe, LAI Xinsheng*
(Acupuncture Rehabilitation Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China )

Point, Taichong (LR 3); SHR; cerebellum; protein expression

245.3

A

2095-6258(2017)04-0526-04

2016-05-08）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.04.004

国家自然科学基金项目（81173349）。

李晓喆（1987 -），女，博士研究生，主要从事针灸康复临床医学研究。

*通信作者：赖新生，男，教授，博士研究生导师，电子信箱-lai1023@163.com

Abstract: Objective To explore the effects on the expression of acupuncture Taichong in spontaneously hypertensive rats cerebellar proteins. Methods 55 SHR rats were randomly divided into model group, non acupoint group, Ququan group, Taichong group, Chongyang group, each group of 11 only. The other 8 Wistar rats as normal group.The model group and the normal group without acupuncture, the other 4 groups corresponding acupuncture Ququan acupoint and non acupoint, Taichong, Chong Yang points, 1 /d, 7 d. Record the blood pressure changes before and after the experiment of mice. Then the mice were sacrifced to obtain cerebellar tissue, results by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry detection to observe the protein expression. Results Blood pressure before and after treatment comparison results show that the model group's blood pressure increased signifcantly (P＜0.05), diastolic blood pressure decreased in A group, systolic and diastolic blood pressure in other acupuncture group is slightly higher, but they had no statistical significance (P＞0.05); Two dimensional electrophoresis and mass spectrometry showed thatcerebellar protein expression increases signifcantly more than Ququan group, Chongyang group and non acupoint groupafter acupuncture at Taichong group. Conclusion The cerebellar tissue protein expression difference after acupuncture at Taichong, the difference in protein functions including promoting metabolites such as peroxide elimination, accelerate the conversion of genetic information, promote nerve regeneration etc.This provides the hypothesis of evidence for the nerve-endocrine-immune network.