张彦慧+张文慧+姜智飞+高金伟+窦勇+周文礼+高建忠

摘 要：裸藻是一种重要的资源微藻，富含丰富的氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素和裸藻糖等营养物质，并且裸藻没有细胞壁，其营养成分相对于其他藻类更容易被人体、水产动物吸收，因此开展裸藻集约化培养及养殖环境优化具有十分重要的意义。为了研究裸藻的无菌化养殖，实验生态条件下，研究了不同浓度的5种抗生素（遗传霉素、氯霉素、青霉素、土霉素和链霉素）胁迫对纤细裸藻（Euglena gracilis）蛋白含量的影响。结果表明：低于25 μg/mL的遗传霉素即可对裸藻蛋白质合成产生抑制，200 μg/mL的氯霉素一定时间内可促进纤细裸藻蛋白的合成。

关键词：抗生素；纤细裸藻（Euglena gracilis）；蛋白含量；胁迫；响应

裸藻（Euglena）已在地球上存在五亿年以上，同时具有动物与植物两种特性，是动植物共同的祖先，于17世纪被荷兰生物学家列文虎克发现并命名。裸藻为淡水性单细胞生物，处于食物链的最底端，生活在阳光充足、有机质丰富的水体中，纤细裸藻（Euglena gracilis）属于裸藻门、裸藻属，通过纵分裂进行繁殖，为兼性营养型[1]，既可以利用葡萄糖等有机物生长[2-4]，又可以进行光合作用自己制造营养，有效地固定环境中的CO2[5]。纤细裸藻含有丰富的营养成分，包括氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、矿物营养物、玉米黄质、叶绿素、黄体素、GABA（γ-氨基丁酸）等59种人体必需的营养元素，其中裸藻多糖是裸藻属特有的成分，可以吸附人体中多余物质，如胆固醇、中性脂肪、重金属、酒精等，并将其排出体外，具有强效抗氧化、抗病毒的作用。

抗生素在调节和控制微藻生长发育方面的作用及其作用机理引起了广大学者的关注[6]。纤细裸藻蛋白含量对抗生素胁迫的响应，国内外鲜有报道。目前已有学者研究了UV-B[7-9]、原油[10]、抗生素[11-12]胁迫下以及无菌[13-14]条件下，微藻的生长变化规律。本文在此研究基础上，选取5种抗生素，实验室条件下初步探讨了5种抗生素胁迫对纤细裸藻蛋白含量的影响，并分析了可能的作用机理，以期为纤细裸藻无菌体系的建立提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 微藻及培养

纤细裸藻（Euglena gracilis）由中国科学院淡水藻种库提供。培养基为AF-6培养液配方，使用去离子水配制，121.3 ℃下滅菌20 min后使用。培养温度：（25±1） ℃，光照：60 μmol·m-2·s-1，光暗比12 L∶12 D。每天摇瓶数次，以防止纤细裸藻附壁或下沉。

1.2 抗生素处理

遗传霉素（Geneticin，G418）、氯霉素（Chloramphenicol，Cm）、青霉素（Penicillin）、土霉素（Oxytetracycline）和链霉素（Streptomycin）购自索莱宝公司。抗生素母液的配制参照萨姆布鲁克等，经细菌过滤器（0.22 μm）抽滤灭菌后使用。

在预实验基础上，将G418、Cm、Penicillin、Oxytetracycline和Streptomycin母液分别加入到对数生长期的纤细裸藻培养液中，抗生素的终浓度为0，25，50，75，100和200 μg/mL（G418为0、25、50、75、100和125 μg/mL），实验过程中保持抗生素终浓度不变。

1.3 实验方法

纤细裸藻的初始接种密度为：5×105个/mL，实验总体积为1 500 mL（每瓶100 mL，3个平行，5个处理组），抗生素处理后，每1 d取一次样，用考马斯亮蓝测定蛋白含量。

1.4 数据统计

采用SigmaPlot 10.0整理数据及绘制图形，SPSS 19.0进行单因素方差分析（one-way ANOVA），设定显著性水平为P<0.05。

2 实验结果

2.1 遗传霉素对纤细裸藻蛋白含量变化

裸藻蛋白含量对遗传霉素胁迫的响应变化较为复杂（图1），G418的刺激作用和抑制效应交替显现，无明显规律，且G418的作用未表现浓度依赖的特征。实验前2天遗传霉素明显刺激了裸藻细胞的蛋白质合成，蛋白含量迅速上升，尤其是实验第2 d各G418处理组蛋白水平均显著高于对照组（P<0.05）。此后裸藻细胞蛋白含量开始回落并呈现起伏变化，从实验第6天起蛋白水平急剧下降并维持较低水平，至实验结束抗生素处理组裸藻蛋白含量与对照组无显著差异（P>0.05）。

2.2 氯霉素对纤细裸藻蛋白含量变化

在氯霉素作用下，裸藻细胞的蛋白含量经历了先升高后降低的变化过程（图2）。实验前4 天蛋白水平总体处于上升阶段，从第6天开始蛋白含量开始下降，至实验结束时氯霉素对裸藻蛋白合成的影响与对照组无显著差异（P>0.05）。实验第1天氯霉素浓度与细胞蛋白含量呈负相关关系，此后氯霉素对蛋白合成的刺激效应逐渐显现，尤其是200 μg/mL组促进作用最为明显。从第5天开始低剂量（25 μg/mL）和高剂量（100和200 μg/mL）交替成为促进裸藻蛋白合成的最适浓度，这也反映了氯霉素对微藻作用的复杂。

2.3 青霉素对纤细裸藻蛋白含量变化

在青霉素胁迫作用下，裸藻蛋白含量波动起伏较大，蛋白水平出现了两个峰值（图3）。实验前2天青霉素刺激了裸藻细胞的蛋白合成，在第2天达到第一个峰值，第3天蛋白含量有所下降，此后逐渐回升，至实验第5和6天裸藻蛋白含量达到第二个高峰，此后细胞的蛋白合成逐渐受到抑制，蛋白含量迅速回落，至实验结束时裸藻细胞蛋白含量已经低于初始水平。青霉素浓度对裸藻蛋白的影响无明显规律，剂量依赖特征不显著。

2.4 土霉素对纤细裸藻蛋白含量变化

在土霉素作用下，裸藻蛋白含量呈先升高后降低的变化趋势（图4）。实验前4天裸藻细胞的蛋白合成受到土霉素刺激，微藻蛋白含量增长较快，从第5天起裸藻的蛋白合成过程逐渐受到抗生素抑制，蛋白水平迅速下降，至实验结束时各处理组裸藻细胞内蛋白含量均低于初始水平。不同的实验阶段，土霉素浓度对裸藻蛋白合成的影响差异较大，促进作用和抑制效应交替出现，未呈现规律性的剂量-效应关系。

2.5链霉素对纤细裸藻蛋白含量变化

在链霉素作用下，纤细裸藻的蛋白含量起伏变化较大（图5）。实验前3天链霉素处理组裸藻蛋白水平呈上升趋势，此后蛋白含量经历了较大起伏，从第7天起逐渐下降并维持较低水平。实验前3天链霉素对裸藻蛋白合成主要起抑制作用，各抗生素处理组蛋白水平均显著低于对照组（P<0.05），此后链霉素对裸藻蛋白合成的作用呈现促进和抑制交替出现的情况，未显示明显规律。

3 讨论

G418是一种氨基糖苷类抗生素，通过干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核细胞产生毒性。有研究[15]指出NptⅡ（Neomycin phosphotransferase-Ⅱ）基因编码产物能够通过酶促磷酸化使氨基糖苷类抗生素失活而降低毒性，但是一般微藻细胞NptⅡ基因表达产物本底值极少，因此许多微藻对G418胁迫十分敏感。周文礼等[16]证实，较低剂量的G418即可显著降低小球藻、金藻、新月菱形藻的叶绿素a含量，而本研究也发现，裸藻蛋白含量对遗传霉素胁迫的响应变化较为复杂，G418的刺激作用和抑制效应交替显现，无明显规律，且G418的作用未表现浓度依赖的特征。链霉素也同属氨基糖苷类抗生素家族，其作用机理与G418十分接近。在本研究中受到鏈霉素胁迫时，纤细裸藻蛋白含量起伏变化较大。以上结果也进一步印证了G418和链霉素不适合作为建立微藻无菌系所使用的抗生素。

氯霉素是从委内瑞拉链霉菌中分离提取的广谱抗生素，对许多需氧革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌、厌氧的菌质体都有抑制作用[7]。不同微藻对氯霉素的胁迫敏感性有显著差异，有人发现亚心形扁藻对25 μg/mL的氯霉素敏感[17]，而200 μg/mL的剂量才能显著抑制小球藻生长[18]，本研究中，实验2～4天氯霉素对蛋白合成的刺激效应逐渐显现，尤其是200 μg/mL组促进作用最为明显。在不同时间点25～200 μg/mL的氯霉素对纤细裸藻蛋白合成存在促进和抑制交替显现的混合效应，这可能与裸藻特殊的生理构造与代谢特征有关。

青霉素通过抑制细菌细胞壁四肽侧链和五肽交连桥的结合，阻碍细菌细胞壁合成从而发挥杀菌作用。有研究指出低浓度青霉素一方面可以通过促进细胞内核酸与蛋白合成来提高叶绿素水平，另一方面能借助降低细胞中叶绿素酶活力来抑制叶绿素降解，从而提高细胞叶绿素含量[19]，而本研究发现在青霉素胁迫作用下，裸藻蛋白含量波动起伏较大，青霉素浓度对裸藻蛋白的影响无明显规律，剂量依赖特征不显著。其原因可能与裸藻没有细胞壁从而使青霉素无作用位点有关。本研究证实在土霉素作用下，裸藻生长和大分子合成受到抑制，实验后期蛋白含量大幅下降，这可能与土霉素可以诱导微藻细胞内活性氧水平升高，对细胞造成不同程度的氧化损伤，从而发挥其生物毒性有关，这也证明了土霉素不适合作为作为建立微藻无菌系所使用的抗生素。

4 结论

纤细裸藻对遗传霉素G418、链霉素和土霉素的敏感性较强，G418、土霉素和链霉素不适合作为建立裸藻无菌系所使用的抗生素。

200 μg/mL的氯霉素一定时间内可促进纤细裸藻蛋白的合成，氯霉素可以作为裸藻无菌系建立的备选抗生素。

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