邱瑞苹，王彩霞

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

自噬相关蛋白LC3A与Ki67在胃腺癌中的表达①

邱瑞苹，王彩霞

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：探讨自噬相关蛋白LC3A在胃腺癌组织中的表达及其与Ki67的关系。方法：采用免疫组化Elivision方法检测55例胃腺癌组织及25例正常癌旁组织LC3A和Ki67的表达情况。结果：(1)LC3A在胃腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)，差异有统计学意义；(2)在胃腺癌组织中LC3A“石头样”结构(“stone-like”structure，SLS)与胃癌浸润深度、淋巴结转移、远处转移及Ki67的表达呈正相关(P均<0.05)。结论：胃腺癌组织“石头样”结构的高表达提示胃癌预后不良，LC3A联合Ki67的检测有助于胃腺癌的进展和预后的评估。

自噬；胃癌；LC3A

胃癌是最常见的消化道肿瘤，根据国际癌症研究机构(IARC)发布的数据，在2012年有951600例新发胃癌病例，其中有723100例死于胃癌[1]，采取合适的治疗手段提高患者的生存质量是成为目前的热点[2]。以往研究表明，肿瘤的发生是正常细胞基因突变后无限增殖与抗凋亡所致,近年来，一种与凋亡相似的生物现象—自噬引起人们的关注[3]。自噬(Autophagy)是指胞浆内大分子物质和细胞器被运送到溶酶体中被大量降解的生物学过程。细胞自噬的发生以胞内出现自噬体(autophagosomes)为主要特征，它是一种双层膜结构、由胞质成分构成的细胞器，通过与溶酶体结合形成自噬溶酶体来降解大分子物质[4]。通过降解细胞内物质，一方面使大分子物质和细胞器降解为氨基酸、核苷酸及游离脂肪酸，并被重新利用以合成新的大分子物质，另一方面，可以减少异常蛋白质和受损细胞器的堆积，维持细胞内稳态。自噬在人类多种疾病中发挥着至关重要的作用，如肿瘤的发生发展、神经退行性疾病、感染、心血管疾病、肺部疾病和人类老化等，在肿瘤方面的研究是近年来的热点。自噬的发生过程总是伴随着自噬相关蛋白(autophagy-related gene，ATG)的调控。迄今为止已发现36种，微管相关蛋白1轻链3(microtuble associated protein light chain 3，MAPLC3)简称 LC3，是哺乳动物ATG8的同源物，是第一个被发现的自噬体标记蛋白,定位于自噬体膜上，其含量的多少与自噬泡的数量正相关，LC3有三种亚型，即LC3A、LC3B、LC3C。临床上经常运用Ki67作为胃癌恶性程度及评估预后的指标[5]。本实验采用免疫组化方法检测胃癌中LC3A和Ki67的表达，探讨其与胃癌临床病理参数的关系，为胃癌的诊断、治疗及预后提供客观的参考指标，同时为胃腺癌分子靶向治疗药物的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 免疫组化石蜡标本:收集佳木斯大学附属第一医院2014-01～2016-04经手术切除的胃腺癌患者的组织蜡块和HE切片。其中胃腺癌组织55例，癌旁正常组织25例。所有研究对象术前均未接受任何辅助治疗，其中男40例，女15例，年龄35～79岁，术后病理证实高-中分化腺癌33例，低分化腺癌22例，有淋巴结转移者39例，无淋巴结转移者16例，有血管侵犯者29例，无血管侵犯者26例，有远处转移者17例，无远处转移者38例。

1.1.2 试剂:兔抗人单克隆抗体LC3A(稀释比：1:200)购自Cell Signaling Technology公司，兔抗人单克隆抗体即用型Ki67、通用型二抗、DAB显色液均购自福州迈新公司。采用已知LC3A阳性表达的脑组织作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2 方法

免疫组化Elivision法：将石蜡脱蜡、水化、自来水冲洗后，进行柠檬酸热修复(pH6.0、热修复2min)，滴加一抗(LC3A、Ki67)，37℃孵育3h，PBS冲洗后滴加放大剂(试剂A)，常温孵育20minPBS冲洗后滴加多聚酶结合物(试剂B)，PBS冲洗后DAB显色(LC3A、Ki67显色时间为2～3min),经过苏木素复染、分化返蓝、透明后封片。

1.3 结果判定

1.3.1 LC3A的判读

弥漫性的胞浆表达为定位于胞浆内弥漫的棕黄色颗粒样着色，采用半定量积分法[4]，即阳性肿瘤细胞比例：小于10%为0分，10%～50%为1分，大于50%为2分，阳性肿瘤细胞强度：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分，两者相乘，0～3分为低表达，4～6分为高表达；石头样表达：主要表现为胞浆内球形深褐色的晕染结构，随机选取十个400倍肿瘤视野计算总的“石头样”结构的个数,取中位数(median value)为截断值[5]，高于中位数(包括中位数)的为高表达，低于中位数的为低表达。

1.3.2 Ki67的判读:Ki67定位于细胞核棕黄色的表达，采用半定量积分法判读。

1.4 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件, 不同分组间蛋白的表达差异及各蛋白与临床病理因素之间的关系采用χ2检验，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LC3A在胃癌组织中LC3A有两种表达方式，即弥漫性胞浆表达(diffuse cytoplasmic)，见图1、图2、石头样表达(“stone-like”structure，SLS)，而在癌旁正常组织(见图1)中只有少量弥漫性胞浆表达，在胃癌组织中，弥漫性胞浆表达方式阳性率为80%(20/25)，明显高于对应的癌旁组织(阳性率为36%)，见表1，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 癌旁正常组织LC3A的表达 (Elivision法×200)(左上方为正常组织、 右下方为胃癌组织)

图2 胃癌组织LC3A弥漫性胞浆表达 (Elivision法×200)表1 胃癌组织与癌旁组织LC3A弥漫性胞浆表达方式的比较

高低高表达率(%)χ2值P胃癌组织20580癌旁组织916369.9<0.05

2.2 “石头样”结构仅见于胃癌组织内，见图3,经分析后得出，每个400倍视野“石头样”结构范围为0～11个，中位数为5，胃癌组织中“石头样”结构高表达率为70%(39/55)，与胃癌的浸润深度、淋巴结转移及Ki67的表达，见图4，呈正相关，差异有统计学意义，见表2。

2.3 弥漫性胞浆表达(高表达率为80%)与胃癌的浸润深度、淋巴结转移数目、血管侵犯及Ki67的表达等无相关性，见表2。

图3 胃癌组织LC3A石头样结构(箭头所示) (Elivision法×400)

图4 胃癌组织Ki67胞核阳性表达 (Elivision法×200)表2 胃癌组织不同表达方式与临床病理之间的关系

石头样结构高低χ2值P弥漫性胞浆表达高低χ2值P分化程度 高-中分化249276 低分化1570.132>0.051750.17>0.05浸润深度 T1～T3910154 T43067.79<0.052970.02>0.05淋巴结侵犯 阳性327336 阴性798.06<0.051151.78>0.05血管侵犯 阳性218263 阴性1880.06>0.051883.57>0.05远处转移 有152134 无24144.19<0.053170.19>0.05Ki67 高296269 低10109.32<0.051821.92>0.05性别 男2614346 女1322.48>0.051052.29>0.05年龄(岁) >60289316 ≤601171.25>0.051351.01>0.05

2.4 在胃癌组织中，高表达的石头样结构伴随着高表达的弥漫性胞浆表达，见表3，可能提示弥漫性胞浆表达反应自噬的基础水平。

表3 LC3A在胃癌组织中不同表达方式的关系

3 讨论

自噬通过清除细胞内受损的蛋白质、细胞器、细胞内病原体，限制炎症反应及自噬性细胞死亡等方式抑制肿瘤的发生；另一方面，自噬通过为肿瘤细胞提供营养物质、抑制凋亡作用、降低肿瘤细胞的敏感性、帮助癌细胞度过休眠期等方式促进癌组织的发展。综上，自噬在肿瘤的发生和进展过程中起着双刃剑的作用。大量文献报道，LC3A在大部分恶性肿瘤中是高表达的，如卵巢癌、肝细胞性肝癌、皮肤鳞癌[6]、非小细胞型肺癌[7]和尿路上皮癌等，在我们的研究中，与癌旁组织(9/25)相比，胃癌组织LC3A表达(39/55)在是明显升高的，表明自噬水平在恶性肿瘤中是升高的；在本实验中，胃癌组织存在两种表达方式，即弥漫性胞浆表达和“石头样”表达，但是弥漫性胞浆表达这种方式与临床病理参数无统计意义，且石头样结构的高表达与弥漫性的胞浆表达正相关，这些研究结果可能提示LC3A弥漫性胞浆表达反映了癌细胞基础的自噬水平。

我们的研究表明，“石头样”结构只表达在胃癌细胞中且与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、远处转移、Ki67的表达呈正相关，提示预后不良，在55例胃腺癌组织中，高表达的石头样结构有39例，高表达率为70%，在17例远处转移的病例中有15例LC3A“石头样结构”高表达，肿瘤恶性程度越高，LC3A“石头样”结构出现的频率越高，肿瘤细胞增殖活性相应的越高。在其他恶性肿瘤中也可以看见相似的现象，例如，在肝细胞性肝癌中，“石头样”结构数目与血清AFP、分化程度、血管侵犯等正相关，在前列腺癌中，“石头样”结构与Gleason评分正相关，综上表明高表达“石头样”的癌细胞代表了更高侵袭性和转移性的癌细胞。

传统手术切除是胃癌根本的治疗方法，但是由于胃癌早期临床症状不明显，所以大部分患者发现时已到中晚期，肿瘤细胞对药物的获得性耐药是癌症治疗的主要障碍，自噬可能在恶性肿瘤细胞的治疗抵抗上扮演着重要的角色。已有研究证明，5-FU(5-氟尿嘧啶)可以使肿瘤细胞发生凋亡，也能使肿瘤细胞发生自噬，这种自噬可以对抗肿瘤细胞发生凋亡，在结肠癌细胞中运用自噬抑制剂3-MA(三甲基腺嘌呤)后，细胞凋亡作用增强[8]，运用自噬调节剂可能是癌症靶向治疗的新思路，而什么样病人运用自噬调节剂可以对临床治疗有帮助呢？在胃癌患者中，LC3A“石头样”结构的高表达可能提示这类患者运用自噬抑制剂会有好的临床效果。对自噬水平明显升高的患者运用自噬阻断剂可能为胃癌的治疗指出新思路。

综上所述，LC3A“石头样”结构可能是监测胃癌预后理想的指标，高表达的“石头样”结构预后差，肿瘤侵袭能力和转移能力强，在以后的研究中，联合检测ATG5、ATG9、ATG12等自噬相关蛋白，运用多种方法检测可能更好的了解自噬在肿瘤的发生发展中的作用。

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Highlights: Objective: Purpose To investigate the expression of autophagy-related gene LC3A in gastric carcinoma tissue and the relationship with Ki-67. Methods: Immunohistochemical method was used to determine the expression of LC3A and Ki67 in 85 cases of gastric adenocarcinoma tissue and 45 cases of normal tissue adjacent to carcinoma. Results：The expression of LC3A was significantly higher in gastric adenocarcinoma than normal tissue adjacent to carcinoma(P<0.05); Stone-like”structure (SLS) counts were closely associated with lymph node metastasis, depth of tumor invasion, metastases distant, and were positively related to the expression of Ki67(P<0.05). Conclusion: The increased number of SLS in gastric carcinoma was related to poor prognosis; it was useful to evaluate the development and the prognosis of the gastric adenocarcinoma by detecting the expression of LC3A and Ki67.

The expression and significance of sutophagy related gene LC3A and Ki67 in gastric adenocarcinoma

QIURui-ping，WANGCai-xia

(Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

autophagy;gastric carcinoma;LC3A

黑龙江省教育厅科研项目，编号：12541825。

邱瑞苹(1988～)女，山西大同人， 在读硕士研究生。

王彩霞(1966～)女，黑龙江绥化人，学士，主任医师，硕士研究生导师。 E-mail：wcx19641027@163.com。

R735.2

B

1008-0104(2017)04-0008-03

2016-12-01)