张海朋 ， 谷 巍 ， 鞠安琪 ， 毕建飞 ， 曲 磊 ， 成 璐 ，陈 龙 ， 康元环 ， 单晓枫 ， 钱爱东

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林长春130118 ； 2.山东宝来利来生物工程股份有限公司 ， 山东泰安271000)

饲料中添加干酪乳杆菌对鲤鱼非特异性免疫力和抗病力的影响

张海朋1， 谷 巍2， 鞠安琪1， 毕建飞1， 曲 磊1， 成 璐1，陈 龙1， 康元环1， 单晓枫1， 钱爱东1

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林长春130118 ； 2.山东宝来利来生物工程股份有限公司 ， 山东泰安271000)

为探讨饲料中添加干酪乳杆菌对非特异性免疫力和抗病力的影响，在基础饲料中分别添加3种不同浓度1×107CFU/g、1×108CFU/g、1×109CFU/g的干酪乳杆菌，养殖初始体重为(28±0.3)g的鲤鱼6周。结果显示，与对照组相比，饲料中添加1×108CFU/g时超氧化物歧化酶(SOD)和抗体IgM含量显著升高(P<0.05)，但1×109CFU/g的SOD活力和抗体IgM含量反而受抑制；在28 d时添加量为1×108CFU/g的溶菌酶(LZM)和过氧化物酶(POD)活力最高，1×107CFU/g、1×109CFU/g的低一些，均高于对照组；而试验各组中碱性磷酸酶(AKP)活力随干酪乳杆菌浓度的增加而升高。饲喂后第42天以菌株维氏气单胞菌TH0426攻毒，各组14 d后的累积死亡率差异显著(P<0.05)，与对照组相比，添加1×108CFU/g的干酪乳杆菌免疫保护率最高为60%，1×107CFU/g、1×109CFU/g的次之。由此可见，在基础饲料中添加1×108CFU/g的干酪乳杆菌能提高鲤鱼的非特异性免疫力，且具有较高的免疫保护效果。

干酪乳杆菌 ； 鲤鱼 ； 酶活力 ； 免疫效果

干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)属于乳杆菌属(Lactobacillus),革兰阳性菌,研究报道干酪乳杆菌对动物宿主具有显著益生作用，能够排斥有害微生物,改善肠道微生物菌群和上皮细胞完整性，增强机体免疫反应等作用[1]，饲料中添加干酪乳杆菌有望能提高鱼类的细胞免疫水平,改善肠道微生物环境。

在我国，鲤鱼养殖规模逐年扩大，但病害的频发制约了鱼类养殖产业的发展。目前，由于抗生素的耐药性以及疫苗的价格过高和使用不便等因素，致使其应用受限[2]，而乳酸菌制剂因使用方便，价格合理，在养殖业中广泛使用，因而可能成为目前有效控制鱼病的一种重要手段。鱼类的非特异性免疫是鱼类抵抗病原微生物感染的重要手段，其吞噬和免疫相关酶类起主要作用。碱性磷酸酶(AKP)广泛存在于鱼类的血液、组织和器官等部位，对鱼类的生长发育及免疫机制起到至关重要的作用；超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶，能够清除体内多余的氧自由基；过氧化物酶(POD)能促进细胞呼吸，提高粒细胞对外源异物的吞噬能力。抗体IgM是鱼类特异性体液免疫应答中最主要的介质,其含量的高低与机体的免疫能力密切相关。因此，探究鱼体内非特异性免疫和抗病力对鱼类免疫机制的研究具有重要意义。本文选用鲤鱼为试验动物，以饲料中添加不同浓度的干酪乳杆菌进行投喂饲养，分析其对LZM、AKP、SOD和POD酶活力变化和抗体IgM含量及抗病力的影响，为干酪乳杆菌在鲤鱼饲料中的合理应用提供理论应用。

1 材料与方法

1.1 试验菌株及动物 干酪乳杆菌C20028株、维氏气单胞菌TH0426株由吉林农业大学预防兽医实验室保存。健康鲤鱼，购自长春某养殖场，暂养 15 d，观察健康无症状后用于试验。

1.2 主要试剂及器材 MRS琼脂，购自北京陆桥生物技术责任有限公司；30 ℃电热恒温培养箱，电热鼓风干燥箱，基础饲料选自山东省原味宠粮源自天然公司生产的鲤鱼全价配合粒状饲料(粗蛋白34%、粗脂肪5.0%、粗纤维8.0%)。LZM、AKP、SOD以及POD和抗体IgM含量检测试剂盒，购自美国TSZ生物公司；Sigma高速台式冷冻离心机。

1.3 细菌培养及干酪乳杆菌饲料添加剂制备 干酪乳杆菌C20028在MRS平板划线30 ℃厌氧过夜培养后，接种单菌落于MRS液体培养基30 ℃厌氧过夜培养。平板计数后用于饲料添加剂的制备。

干酪乳杆菌饲料添加剂的制备参考李卓佳等(2003)方法略有改动制备干酪乳杆菌饲料添加剂。具体如下：干酪乳杆菌C20028接种在MRS液体培养基中 30 ℃过夜厌氧培养，菌悬液5 000 r/min(4 ℃)离心15 min,弃去上清，并加入等量无菌PBS，反复离心3次后平板计数干酪乳杆菌的菌液浓度，以无菌PBS调整菌液浓度为1×107、1×108、1×109CFU/g后将菌液均匀的喷洒到基础饲料中，再将喷洒过干酪乳杆菌的饲料放到恒温40 ℃的烘干箱中烘干，直至饲料变干，同时取少部分烘干的饲料进行菌落计数，验证饲料中干酪乳杆菌的菌液浓度也为1×107、1×108、1×109CFU/g。放到4 ℃冰箱保存备用。

1.4 饲养管理 选择240尾体重为(28±0.3)g，体态正常,健康无病的鲤鱼，将240尾暂养后的鲤鱼随机分为4组，作为对照组和3种基础饲料中添加干酪乳杆菌的浓度为1×107、1×108、1×109CFU/g的3个组，每组做3个重复组，每个重复组20尾鱼，全程水温为25℃±1℃，试验前两周使用基础饲料进行驯化，待鱼稳定后开始以组为单位投喂添加不同浓度干酪乳杆菌的基础饲料，每天投喂3次，试验各组投喂添加不同浓度的干酪乳杆菌饲料7 d后，投喂不添加干酪乳杆菌的基础饲料7 d，然后再投喂含干酪乳杆菌的饲料，以此类推，其余时间均投喂不含干酪乳杆菌的基础饲料，而对照组始终投喂基础饲料，试验期为6周。

1.5 血清样品采集 在养殖第0天、7天、14天、21天、28天、35天、42天时，每组随机抽取3尾鱼。用10%丁香油麻醉，采用尾静脉采血法抽取鲤鱼血液置于 5 mL灭菌离心管中，分组标号，在室温下放置1 h后，置于4 ℃冰箱中过夜，待血清充分析出后以3 500 r/min 离心15 min,制得血清，-40 ℃保存。

1.6 酶活力检测 血清中LZM,AKP,POD和SOD酶活力和抗体IgM含量的测定，均采用美国TSZ生物公司提供的检测试剂盒，相应操作按说明书进行。酶活力单位各说明书已标明。

1.7 攻毒试验 试验用维氏气单胞菌TH0426来自本实验室保存，菌液用LB液体培养在30 ℃培养箱中培养24 h，用灭菌生理盐水清洗，集菌，6 000 r/min 离心15 min，收集沉淀细菌体，反复洗菌3次后，进行梯度稀释，确定适宜攻毒浓度(1×106CFU/mL)后，置4 ℃冰箱保存备用。养殖试验结束后，每组取20尾鱼进行攻毒试验，每尾腹腔注射维氏气单胞菌TH0426 0.2 mL，每组继续投喂试验饲料饲养，计算14 d的累积死亡情况，计算存活率。

1.8 数据分析 利用SPSS 16.0数据分析软件进行单因素方差分析, 结果用平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 血清中LZM、SOD、AKP、POD酶活力变化 从图1可以看出，试验各组LZM活力与对照组相比，在饲喂后都逐渐上升，其中1×108CFU/g的LZM活力在28 d为最高，达到0.578 IU/L,差异极显著(P<0.01)，并在35 d和42 d保持稳定，而1×107CFU/g和1×109CFU/g组中LZM活力较低，但仍高于对照组水平。

从图2可以看出，1×107CFU/g、1×108CFU/g组中SOD活力在28 d时活力最显著，而在28、42 d时1×109CFU/g组对SOD的活力具有抑制作用。

从图3可以看出，1×107CFU/g、1×108CFU/g和1×109CFU/g组中血清AKP活力显著下降(P<0.05)，但在28 d～42 d时AKP活力都上升，其中1×109CFU/g组中AKP活力上升最高，随后基本稳定。

从图4可以看出，试验各组POD活力在饲喂前后基本无变化，但在第14天时都趋于上升，且1×108CFU/g组POD活力均高于1×107CFU/g和1×109CFU/g组，各组在随后第28～42天趋于稳定。

图1 饲喂后各组血清LZM活力变化

图2 饲喂后各组血清SOD活力变化

图3 饲喂后各组血清AKP活力变化

图4 饲喂后各组血清POD活力变化

2.2 血清中抗体IgM含量的检测 饲喂不同浓度的干酪乳杆菌后1×107CFU/g和1×108CFU/g组中IgM含量随浓度增加而升高(P<0.05)，而1×109CFU/g组中IgM含量出现抑制现象，可见饲喂过高浓度的干酪乳杆菌可抑制IgM的生成。

2.3 免疫保护力检测结果 免疫后第42天以维氏气单胞菌TH0426进行攻毒试验，对照组从第1天和第2天开始出现大量死亡，在第6天死亡率达到100%。1×107CFU/g、1×108CFU/g和1×109CFU/g组在攻毒后5 d死亡数量逐减，在第7天以后没有死亡情况，观察14 d后，根据公式计算出1×107CFU/g、和1×109CFU/g组的相对免疫保护率 RPS 为45%和35%，而1×108CFU/g组的相对免疫保护率 RPS 最高为60%，试验组及对照组在攻毒后鲤鱼具体死亡数量可见图6

3 讨论

非特异性免疫系统是鱼类的基本防御机制，在抗病力上比特异性免疫系统更重要。溶菌酶(LZM)可以协调其他免疫因子共同抵制病原的入侵，是衡量免疫功能及机体状态的指标[3]。本试验各组血清中LZM活力稳定升高,均高于对照组水平，且1×108CFU/g组在第28天达到最高值，之后呈下降趋势，这与王雷[4]报道的试验结果相似,表明干酪乳杆菌可以提高鲤鱼血清中LZM活力，进而增强对外源微生物侵染的防御能力。

图5 饲喂后各组血清IgM含量变化

图6 菌株维氏气单胞菌TH0426攻毒后的存活曲线

超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶，能使动物免除自由基造成的危害。本文中1×107CFU/g、1×108CFU/g组SOD活力显著提升，而1×109CFU/g组的SOD活力受抑制，此结果与冼健安[5]等报道的基本一致，据此推测所用的干酪乳杆菌在低浓度时对SOD活力具有促进作用。

碱性磷酸酶(AKP)是重要的解毒体系，可增强机体对病原的识别和吞噬能力，是衡量机体免疫功能的重要指标之一。本试验各组AKP活力在早期阶段呈下降趋势，但在第28天，各试验组AKP活力出现上升趋势，随后趋于稳定。这与谭初斌[6]等研究结果相似，表明饲喂干酪乳杆菌后可改善鲤鱼血清中AKP活力。

过氧化物酶(POD)属抗氧化酶类,在体内分解H2O,对体内氧自由基的清除具有重要作用，可以提高机体的解毒功能和防病抗病能力。本试验中，各组POD活力在7 d、14 d时基本无变化，但到28 d时POD活力上升，且1×108CFU/g组POD活力最高，到35 d、42 d时趋于稳定。这可能是适当浓度的干酪乳杆菌提高了POD活力。

在体液免疫中，抗体IgM的合成可抵御外源异物的入侵，因此抗体IgM含量可作为评价鱼类免疫强弱的重要指标。本试验中，1×107CFU/g、1×108CFU/g组的IgM含量上升，而1×109CFU/g组的IgM含量处于较低水平。因此，我们发现饲喂低浓度的干酪乳杆菌能促进IgM生成，而高浓度反而抑制IgM生成。这与李春翠[7]试验结果相一致，表明适当浓度的干酪乳杆菌能促进鲤鱼产生IgM免疫球蛋白。

攻毒试验显示，1×108CFU/g组的相对免疫保护率最高为60%，表明饲喂添加1×108CFU/g的干酪乳杆菌能提供一定的保护力，充分证实干酪乳杆菌能显著提高鲤鱼的抗病能力。

综上所述，饲料中添加1×108CFU/g的干酪乳杆菌能提高鲤鱼血清中LZM、SOD、AKP、POD酶活力和IgM含量，并提供了一定的保护力，进而增强了鲤鱼的非特异性免疫，本研究结果为鱼类口服疫苗的研制提供了重要参考。

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Effects of non-specific immunity and disease resistance of feeding Lactobacillus casei on common carp

ZHANG Hai-peng1， GU Wei2, JU An-qi1， BI Jian-fei1， QU Lei1， CHENG Lu1， CHEN Long1， KANG Yuan-huan1， SHAN Xiao-feng1， QIAN Ai-dong1

(1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China； 2.Shandong Baolai to Biological Engineering Co., Ltd，Taian 271000，China)

To investigate the effects of the feed of Lactobacillus casei on non-specific immunity and disease resistance in carp，three different concentrations of Lactobacillus casei (1×107CFU/g,1×108CFU/g,1×109CFU/g) were added to the basal diet for 6 weeks, and the initial culture weight of carp was 28±0.3g.The results showed that the contents of SOD and IgM increased significantly (P <0.05) at 1 × 108CFU / g, but the contents of SOD and IgM were inhibited at 1 × 109CFU /g.The LZM and POD activities (1 × 108CFU / g) were the highest at 28d, and 1 × 107CFU / g and 1 × 109CFU / g was lower than 1 × 108CFU / g, all the experimental groups were higher than the control group. While the activity of AKP in all experimental groups increased with the concentration of Lactobacillus casei. On the 42 day after feeding, the fishes were challenged with Aeromonas hydrophila strain TH0426, there were significant differences in the cumulative mortality after 14 days (P <0.05).Compared with the control group, the immune protection rate of Lactobacillus with 1 ×108CFU/g was 60%, followed by 1 × 107CFU/g, 1 ×109CFU/g. Thus, adding 1 × 108CFU / g of Lactobacillus casei to the basal diet could improve the non-specific immunity of carp and have higher immune protection effect.

Lactobacillus casei ; Carp ; Enzyme activity ; Immune effect

s: QIAN Ai-dong ; SHAN Xiao-feng

2016-12-09

国家自然科学基金项目(31201927)；吉林省重点科技攻关项目(20150204065NY)

张海朋(1989-)，男，硕士生，从事动物分子免疫学研究，E-mail：zhanghaipeng211@163.com

钱爱东，E-mail：qianaidong0115@163.com; 单晓枫，E-mail：sxf1997@163.com

TS2

A

0529-6005(2017)07-0085-04