曹礼静 ， 袁丽花 ， 廖开燕

(1.重庆市荣昌区职业教育中心 ， 重庆荣昌 ， 402460 ； 2.重庆市荣昌初级中学 ， 重庆荣昌 ， 402460)

一种防治鸡大肠杆菌病的中药复方的筛选

曹礼静1， 袁丽花1， 廖开燕2

(1.重庆市荣昌区职业教育中心 ， 重庆荣昌 ， 402460 ； 2.重庆市荣昌初级中学 ， 重庆荣昌 ， 402460)

为筛选出具有显著效果的治疗鸡大肠杆菌病的中药复方，本试验拟定了5个中药复方，通过进行体外体内抑菌试验来评价其抗菌效果。体外抑菌试验主要通过牛津杯法测定单味药及不同中药复方的抑菌圈大小来评价大肠杆菌对药物的敏感度，体内试验主要利用对人工建立的病鸡模型的治疗效果对5个中药复方进行筛选。结果显示，浓度为1.0 g/mL的提取液抗菌效果较0.5 g/mL的提取液抗菌效果好，当提取液浓度为1.0 g/mL时，大肠杆菌对大黄、地锦草高度敏感；对黄芩、十大功劳中度敏感；对中药复方组方I、II、III、IV、V中度敏感。临床试验结果显示，中药复方III组治疗效果较好，治愈率为71.4%，死亡率为14.3%，而模型组治愈率为11.1%，死亡率为66.7%，差异极显著(P<0.01)。结论提示，中药复方III组对鸡致病性大肠杆菌病有较好的治疗效果。

鸡 ； 大肠杆菌病 ； 中药

鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的，主要表现有胚胎和幼雏的死亡、急性败血症、气囊炎、心包炎、输卵管炎、全眼球炎和大肠杆菌性肉芽肿等[1]。致病性大肠杆菌感染鸡后，鸡主要表现为精神委靡不振、采食减少、离群呆立或蹲伏不动、冠髯呈青紫色、眼虹膜呈灰白色、视力减退或失明、羽毛松乱、肛门周围羽毛粘有绿色或黄白色稀粪、关节肿大、不愿动或跛行[2]。由于致病菌株的血清型多样、致病机理复杂，使用灭活疫苗和亚单位疫苗进行免疫接种易导致接种失败，常给养禽业造成无法估量的经济损失[3-4]。

现代研究表明，中药中抑菌或抗菌的成分很多，可作用于细菌繁殖的不同阶段和多个代谢环节，且不容易产生耐药性，具有改变、抑制，甚至消除细菌的耐药性作用[5]。本试验在中兽医学理论指导下，以不同的药物为主配伍组方，对所拟方剂进行筛选，以期得到有较好疗效的治疗鸡大肠杆菌病的中药复方。

1 材料与方法

1.1 试验动物 选用来自同一养殖场的同一批1周龄健康三黄鸡80只，均按要求进行免疫接种，饲喂不含任何添加剂及药物的饲料，适应性饲养观察至18日龄，选用正常鸡进行试验。

1.2 单味中药提取液抑菌试验

1.2.1 单味中药提取液的制备 将十大功劳、黄芩、大黄、马齿苋、地锦草、鬼针草等6味中药各50 g。分别加入1 L水，浸泡30 min，煎煮1.5 h，过滤，收集滤液，药渣再加入1 L水，煎煮40 min，过滤，收集滤液，药渣再加入1 L水，煎煮30 min，过滤，收集滤液，合并3次滤液，100 ℃下蒸发浓缩至100 mL，再取50 mL第一次的浓缩液浓缩至25 mL，即分别制得单味药材的提取液，提取液以1 000 r/min离心15 min，取上清液，在105 ℃下灭菌，4 ℃保存备用。

1.2.2 菌液的制备 将菌株用划线法接种到普通琼脂平板上，37 ℃生化培养箱培养18～24 h，勾取单个菌落，用灭菌的生理盐水稀释校正菌液浊度至0.5麦氏单位，即菌液浓度为1.5×108CPU/mL，现配现用[6]。

1.2.3 药敏试验 采用牛津杯法及药敏纸片法对大肠杆菌进行药敏试验，观察并测量抑菌圈大小，根据表1[7]记录试验结果。牛津杯法：采取无菌操作将灭菌的不锈钢小管，放在培养基上，轻轻地加压，使其与培养基之间零空隙，每个平板放4个，分别向各牛津杯中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢，并标记各种中药的名称。药敏纸片法：自制直径6 mm的滤纸片药敏纸片，高压灭菌烘干并浸泡于中药浓缩液中过夜，60 ℃烘干，无菌保存。

表1 中药敏感性试验的结果评定标准

1.3 中药复方抑菌试验

1.3.1 中药复方提取液的制备 按表2中各复方配比称取相应药材，其总重量为120 g，然后加入2.4 L水，浸泡30 min，煎煮1.5 h，过滤，收集滤液，药渣再加入2.4 L水，煎煮40 min，过滤，收集滤液，药渣再加入2.4 L水，煎煮30 min，过滤，收集滤液，合并3次滤液，100 ℃下蒸发浓缩至240 mL，再取120 mL第一次的浓缩液浓缩至60 mL，分别制得5种中药组合物的提取液，提取液以1 000 r/min离心15 min，取上清液在105 ℃下灭菌，4 ℃保存备用。

表2 中药复方组成

1.3.2 药敏试验 采用牛津杯法进行中药复方的药敏试验，观察并记录试验结果，方法同1.2.3。

1.4 自拟中药复方对人工感染鸡大肠杆菌病的防治作用

1.4.1 模型建立 试验鸡胸肌注射大肠杆菌菌液0.3 mL/只[8](菌液浓度为1.5×108CFU/mL)，若鸡出现精神迟钝、垂翅、呆立、食欲减少、拉稀和呼吸困难；鸡尸体剖检后，心包膜和肝脏有淡黄色纤维素薄膜，很容易从脏器表面剥离，心脏壁变薄，心包液增多，有纤维素渗出，气囊混浊等典型的特异性病变，并分离出相应的大肠杆菌[9]，即证明模型建立成功。

1.4.2 试验分组与处理[10]试验鸡饲养到18日龄，检查体况无异常现象后，将其随机分为模型组、空白对照组、中药复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组、氨苄西林钠对照组，每组10只。除空白对照组外，其余各组按0.3 mL/只，胸肌注射菌液。待鸡只出现大肠杆菌病的典型症状以后，模型组、空白对照组灌服生理盐水、阳性药物组肌肉注射氨苄西林钠，各中药复方组分别灌服相应中药复方提取液0.5 mL/只，每天2次，连用7 d，具体见表3。每天定时观察并记录鸡只的精神状况、饮食、粪便、死亡等临床表现等。若试验鸡精神、饮食、排粪恢复正常，症状完全消失，即为治愈；若出现精神、饮食、排粪有好转，症状明显减轻，则为有效；若症状无好转甚至死亡，剖检有明显的心包炎、肝周炎等典型大肠杆菌病变，即为无效[11]。

2 结果

2.1 单味中药提取液对鸡致病性大肠杆菌的抑菌效果 由表3可知，本试验所选中药对致病性大肠杆菌均有一定的抑菌效果，牛津杯法抑菌效果优于药敏纸片法，且浓度为1.0 g/mL的提取液抗菌效果较0.5 g/mL的提取液抗菌效果好。当浓度为1.0 g/mL时，大黄、地锦草的抑菌圈直径分别为24 mm、22 mm，黄芩、十大功劳的抑菌圈直径均为16 mm，说明鸡致病性大肠杆菌对大黄、地锦草高度敏感；对黄芩、十大功劳中度敏感。

表3 单味中药提取液对鸡致病性大肠杆菌的抑菌效果

2.2 中药复方对鸡致病性大肠杆菌的抑菌效果 由表4可知，当提取液浓度为0.5 g/mL时，中药复方Ⅲ、Ⅳ组对大肠杆菌的抑菌圈为20 mm，中药复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ组大肠杆菌的抑菌圈直径分别为18 mm、16 mm、16 mm，说明大肠杆菌对中药复方Ⅲ、Ⅳ高度敏感；对中药复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ中度敏感；当提取液浓度为1.0 g/ml时，中药复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ抑菌圈直径分别为18 mm、18 mm、19 mm、19 mm、19 mm，说明大肠杆菌对中药复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中度敏感。根据抑菌圈大小综合考虑，当提取液浓度为1.0 g/mL时，对大肠杆菌的抑制效果更好。

表4 中药复方对鸡致病性大肠杆菌的抗菌效果

2.3 自拟中药复方对人工感染鸡大肠杆菌病的治疗效果

2.3.1 造模结果 造模5 d后试验鸡出现精神迟钝、垂翅、呆立、食欲减少、拉稀和呼吸困难；尸体剖检发现心包膜和肝脏有淡黄色纤维素薄膜，很容易从脏器表面剥离，心脏壁变薄，心包液增多，有纤维素渗出，肝脏质地变脆、易碎，气囊混浊增厚有淡黄色渗出物等病变；革兰染色镜检观察到大肠杆菌，并从肝脏、心脏分离出大肠杆菌，证明试验造模成功。

2.3.2 治疗结果 由表5可知，中药复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组治愈率分别为40%、62.5%、71.4%、44.4%、55.6%，死亡率分别为20%、25%、14.3%、44.4%、33.3%；模型组治愈率为11.1%，死亡率为66.7%，与模型组相比中药复方组均有一定的治疗作用，且中药复方III组治愈率最高，死亡率最低，说明中药复方III组治疗鸡大肠杆菌病效果较好。

3 分析讨论

根据中兽医及鸡大肠杆菌病的“六淫辩证”理论，鸡大肠杆菌病为湿邪致病。湿邪侵入机体使脾阳受困、脾失健运，久之则化热而成湿热之邪。脾主运化，喜燥恶湿，具有消化、吸收、运输水湿的功能，脾运化水湿功能失常就会导致水湿停滞形成内湿，水湿停留于肠道形成腹泻。鸡大肠杆菌主要临床症状中，热邪结于肠可见拉黄色或绿色稀粪，热邪伤肝可见肝脏表面散布多量针头大的坏死点，热邪侵害心脏包膜，表现为纤维素性心包炎。因此，湿热壅积是鸡大肠杆菌病的主要病机和基本证候类型。

根据鸡大肠杆菌病的中兽医辨证，治疗时宜采用清热解毒、燥湿止痢药为主药，所以方中选用黄芩、大黄、十大功劳、马齿苋、地锦草、鬼针草等具有清热解毒、清热燥湿、凉血止痢的药物。本试验结果表明，黄芩、大黄、十大功劳、马齿苋、鬼针草、地锦草等清热解毒药均有一定的抗大肠杆菌作用，其中大黄、地锦草抗菌效果较好。此外，患病鸡抵抗力较差，下痢后易脱水，加之前面使用大苦大寒类的清热药易伤脾胃，耗损津液，所以在清热的同时应辅以健脾胃、养阴凉血的药物，所以添加白术、地黄作为辅药，白术的主要功效是健脾益气，燥湿利水；地黄的主要功效是清热凉血，生津润燥。试验结果显示，各中药复方组在体外均有一定的抗菌效果，但Ⅲ组、Ⅳ组的抗菌效果最好。因此，清热药、祛湿药、补虚药是治疗鸡大肠杆菌病时遣方用药的关键，认为在实际应用中这些药能取得良好的治疗效果。所以试验将上述中药按不同比例组成五个中药复方组，分别给鸡灌服进行体外抑菌试验，期望为临床治疗该病提供良好的理论基础。

根据前人研究表明，不同品种、不同日龄的鸡对鸡大肠杆菌的敏感性不一样，国内常用1～28日龄的海蓝褐蛋鸡、三黄鸡、AA肉鸡等用于试验，本试验选用18日龄的三黄鸡作为试验动物。蔡玉梅等[12]通过皮下注射的方式将O1、O2、O78菌种混合液接种于12日龄雏鸡，发现在菌液、接种途径、鸡日龄等不变的情况下，1.5×108CFU/mL和1.8×108CFU/mL 2个剂量组能够引起鸡发病率达到100%，死亡率分别为83%和93%。当前，国内外学者主要攻毒途径有腹腔注射、胸肌注射、气囊接种。周秀红等[13]研究了不同接种途径对人工诱发鸡大肠杆菌病的影响，结果发现，胸肌注射的致病性最强，其次是皮下注射。结合前人研究结果，将分离到的鸡大肠杆菌复壮后按1.5×108CFU/mL的浓度给鸡进行胸肌注射，注射第5天时，发现鸡只拉稀，精神极度沉郁，并出现死亡，证明造模成功。在造模成功的基础上，给试验鸡灌喂试验所选中药复方，试验结果表明，与模型组比较，各给药组均有一定的治疗效果，但中药复方Ⅲ组治愈率为71.4%，死亡率为14.3%，效果较其他组好。

中药复方Ⅲ组中十大功劳泻热退火，地锦草清热解毒，利湿退黄，鬼针草清热解毒，共为君药。黄芩清肺，肺清则通调水道，而湿热下逐，肠肺复其燥金之气；大黄取其清热泻火、解毒作用，并借通便作用，使热毒下泄，共为臣药。白术的主要功效是健脾益气，燥湿利水；地黄的主要功效是清热凉血，生津润燥，共为佐使药。诸药合用体现中兽医整体观念，辨证论治的基本原则，使遣方用药更有依据可循，也为中兽药治疗鸡大肠杆菌病提供了一定的理论基础。

[1] 唐金花.苦参等中草药的抑菌作用、机理研究及对鸡大肠杆菌病的防治效果分析[D].大连:辽宁师范大学,2006.

[2] 索朗扎西,范云鹏,麻武仁,等.锦珠草颗粒对人工感染鸡大肠杆菌病的防治试验[J].中国兽医学报,2015, 35(02):319-324.

[3] 王双山,欧阳素贞,刘书梅,等.中草药复方防治肉仔鸡大肠杆菌病效果的研究[J].畜牧兽医杂志,2008,27(1):9-10,13.

[4] 刘丽艳.中草药制剂防治鸡大肠杆菌病的实验研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2005.

[5] 贺常亮.治疗鸡大肠杆菌病的中药方剂筛选及其作用机理研究[D].吉林:吉林大学,2011.

[6] 杨斯琴.抑菌蒙药复方筛选及其对肠黏膜屏障的作用机制研究[D]. 呼和浩特:内蒙古农业大学,2016.

[7] 苏丽娟,谢慧,吴玉臣,等.自拟复方中草药防治鸡大肠杆菌病疗效研究[J].安徽农业科学,2007,35(36):11 841-11 842.

[8] 牛建民,王俊杰,靳国旺.中草药制剂对人工感染肉仔鸡大肠杆菌病的防治试验[J].安徽农业科学 ,2007,35(21):6 435-6 507.

[9] 张敬礼,王双山,张国政,等.中草药制剂对人工感染肉仔鸡大肠杆菌病防治效果的研究[J].中国畜牧兽医,2006,33(06):85-87.

[10] 王亮.中药复方“加味白头翁”颗粒剂的研制及其对鸡大肠杆菌病的疗效观察[D].雅安:四川农业大学,2012.

[11] 贺常亮,韦旭斌,付本懂,等.治疗鸡大肠杆菌病的中药方剂筛选[J].中国兽医学报,2013, 33(12):1 917-1 922.

[12] 蔡玉梅,尹逊河,柴同杰,等.人工感染鸡大肠杆菌病的研究[J].中国预防兽医学报,2006,28(3):356-358.

[13] 周秀红,祁克宗,朱良强,等.人工诱发鸡新城疫的攻毒条件的比较研究[J].家禽科学,2005,8:10-12.

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《中国兽医杂志》编辑部

Screening of Chinese medicine compound for preventing and treating colibacillosis in chicken

CAO Li-jing1， YUAN Li-hua1， LIAO Kai-yan2

(1.Rongchang Vocational Education Center of Chongqing，Chongqing 402460，China; 2.Rongchang junior school of Chongqing，Chongqing 402460，China)

In order to obtain a better curative effect of traditional Chinese medicine compound for treating colibacillosis of chicken.Based on the theory of veterinary medicine, this test developed five Chinese medicine prescriptions and the antibacterial effect would be evaluated in vivo and in vitro. In vitro,the method of Oxford cup was used to measure the diameter of antibacterial circle of the single herb and Chinese herbal compound to evaluate the antimicrobial effect. in vivo, the five traditional Chinese medicine compound were screened by chicken colibacillosiscaused by artificial Infection.The Results showed that the antibacterial effect of 1.0 g/mL was better than 0.5 g/mL, when the concentration of the extract was 1.0 g/mL, Escherichiacoliwas highly sensitive to Rhubarb and Humifusa Euphorbia, and was mild sensitive to Scutellaria and Chinese Mahonia, and traditional Chinese medicine compound I, II, III, IV and V. The clinical test results showed that the traditional Chinese medicine compound group III had better effect to chicken，its cure rate and mortality rate were 71.4% and 14.3%,while the model group，s cure rate was 11.1% and mortality rate was 66.7%,between them the difference was significant(P<0.01). It concluded that the traditional Chinese medicine compound group III had a better therapeutic effect on Chicken Colibacillosis.

chicken ; colibacillosis ; traditional Chinese Medicine

2017-02-17

曹礼静(1972-)，男，研究员，硕士，从事中职畜牧兽医教学和研究及教育管理研究， E-mail：caoLij888@126.com

S853.72

A

0529-6005(2017)07-0066-04